[发明专利]与细胞色素P450酶共表达的细胞模型构建及应用

权利要求书

1.一种与细胞色素P450酶共表达的细胞模型构建，其特征在于，通过以下步骤实现：

设计含有KpnⅠ，XhoⅠ两个酶切位点的引物，引物序列如SEQ ID No: 1，2所示，将终止密码子之前带有组氨酸标签的人CYP3A4 cDNA克隆于载体质粒pcDNA3.1(+)-Hygro上，构建表达质粒pcDNA3.1(+)-Hygro-CYP3A4，表达质粒转染MDCK-pcDNA3.1(+)及MDCK-hOCT1细胞，转染后通过氨基糖苷类抗生素G418及潮霉素B进行抗性筛选，挑选单克隆细胞，单克隆细胞进行western blot验证 CYP3A4的蛋白表达，得到稳定表达CYP3A4的MDCK-CYP3A4及MDCK-hOCT1-CYP3A4细胞，并通过Western blot从中挑选出CYP3A4蛋白表达量一致的细胞，提取总RNA，通过引物序列如SEQ ID No: 4-9所示的特定引物进行Real-time PCR验证细胞中CYP3A4及hOCT1的mRNA表达，并与空载体细胞及MDCK-hOCT1进行比较，进而以P450-Glo? CYP3A4 Assay试剂盒检测CYP3A4活性，并考察酮康唑对代谢活性的影响，从而确认转染细胞CYP3A4的功能；应用hOCT1荧光底物4-(4-(dimethylami-no)styryl)-N-methylpyridinium，结合hOCT1抑制剂四乙胺验证细胞hOCT1的功能；其中人CYP3A4 cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No: 3所示。

2.根据权利要求1所述方法构建的一种与细胞色素P450酶共表达的细胞模型在研究CYP3A4及hOCT1介导的肝脏毒性中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过以下步骤实现：单转、双转及mock细胞给予不同浓度的待测化合物，孵育一定时间，采用MTT法检测细胞的存活率，通过比较单表达、共表达hOCT1或/和CYP3A4的细胞及mock细胞的存活率确认hOCT1及CYP3A4在待测化合物的细胞毒性中作用。