[发明专利]与细胞色素P450酶共表达的细胞模型构建及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物领域，涉及一种共表达人有机阳离子转运体1及细胞色素P450酶细胞模型的构建及应用。

背景技术

人肝脏表达多种药物代谢酶和转运体，是药物体内处置的重要器官。细胞色素P450（CYP）是人肝脏中最主要的一相代谢酶，它们介导药物的氧化还原反应，使药物失活或激活。CYP3A4是肝脏中表达最多的CYP酶，占其总CYP酶的30%,目前临床应用的药物中近50%由CYP3A4代谢[1]。由于CYP3A4底物谱广，因此由其介导的药物-药物相互作用也十分普遍[2]。膜转运体介导大量药物及其代谢物的摄取和外排，是很多药物体内处置的决定性因素，因此转运体在药物-药物相互作用过程中也发挥着重要作用[3, 4]。临床上有近40%的口服药物为弱碱性化合物，在生理pH条件下部分或全部以阳离子存在[5]，因此它们进出细胞往往需要由膜转运蛋白介导，有机阳离子转运体1（organic cation transporter 1, OCT1）即是其中一种。人OCT1是肝脏中一种重要的膜转运蛋白，可介导许多阳离子化合物的摄取[6]。鉴于代谢酶和转运体对药物处置的重要作用，药物与代谢酶、转运体的相互作用研究已成为新药研发过程中不可或缺的研究内容，对其成药性评价具有重要指导意义。由于转运体与代谢酶存在广泛的底物谱交叉性，因而体外研究中需要综合考量它们共同的作用。体外研究常用的永生化肝细胞系，如HepG2, HepaRG, Huh7, 以及L-02等[7, 8]，由于代谢酶与转运体表达的缺失或过低，不适合进行药物转运与代谢研究；而人源的细胞器、组织等来源有限、成本高，且很难研究专一酶的作用或/及其与转运体的共同作用。因此稳定表达人转运体/CYP酶的转基因细胞模型，是一种较理想的体外研究模型。本研究在已有稳定表达hOCT1细胞模型[9]的基础上，建立稳定表达人CYP3A4的马丁达比狗肾上皮（MDCK）细胞模型及共表达hOCT1和CYP3A4的MDCK细胞模型，为体外专一的研究hOCT1，CYP3A4及两者的共同作用提供了有效的细胞模型。

发明内容

本发明的目的是提供一种与细胞色素P450酶共表达的细胞模型构建，是一种与细胞色素P450酶共表达的细胞模型构建，也是一种稳定高表达CYP3A4及共表达hOCT1,CYP3A4的MDCK（马丁达比狗肾上皮）细胞模型的构建，通过以下步骤实现：

通过设计含有KpnⅠ，XhoⅠ两个酶切位点的引物（引物序列如SEQ ID No: 1，2所示），将终止密码子之前带有组氨酸标签的人CYP3A4 cDNA（核苷酸序列如SEQ ID No: 3所示）克隆于载体质粒pcDNA3.1(+)-Hygro上，构建表达质粒pcDNA3.1(+)-Hygro-CYP3A4。表达质粒转染MDCK-pcDNA3.1(+)及MDCK-hOCT1细胞，转染后通过氨基糖苷类抗生素G418及潮霉素B进行抗性筛选，挑选单克隆细胞，单克隆细胞进行western blot验证 CYP3A4的蛋白表达，得到稳定表达CYP3A4的MDCK-CYP3A4及MDCK-hOCT1-CYP3A4细胞，并通过Western blot从中挑选出CYP3A4蛋白表达量一致的细胞，提取总RNA，通过特定引物（引物序列如SEQ ID No: 4-9所示）进行Real-time PCR验证细胞中CYP3A4及hOCT1的mRNA表达，并与空载体细胞及MDCK-hOCT1进行比较，进而以P450-Glo? CYP3A4 Assay试剂盒检测CYP3A4活性，并考察经典抑制剂酮康唑对代谢活性的影响，从而进一步确认转染细胞CYP3A4的功能。此外，应用hOCT1荧光底物4-(4-(dimethylami-no)styryl)-N-methylpyridinium（ASP⁺），结合hOCT1抑制剂四乙胺（TEA）验证细胞hOCT1的功能。

本发明的另一个目的是提供所构建的模型在研究CYP3A4及hOCT1介导的肝脏毒性中的应用。通过以下步骤实现：单转、双转及mock细胞给予不同浓度的待测化合物，孵育一定时间，采用MTT法检测细胞的存活率。通过比较单表达、共表达hOCT1或/和CYP3A4的细胞及mock细胞的存活率来说明hOCT1及CYP3A4在待测化合物的细胞毒性中起的作用。