[发明专利]一种含有藻类的水中“两虫”的富集、纯化方法及其含量测定方法

权利要求书

1.一种含有藻类的水中隐孢子虫和贾第鞭毛虫的富集、纯化方法，包括如下顺序进行的步骤：

1）加压处理

对含有藻类的水进行加压处理，然后静置放置，获得上清液；

2）浓缩、富集处理

首先，采用醋酸纤维滤膜对上清液进行过滤；接着将过滤后醋酸纤维滤膜和滤膜截留物加入到丙酮中，溶解、分散，获得丙酮溶解-分散混合物；然后对丙酮溶解-分散混合物进行离心处理，收集沉淀，获得“两虫”富集沉淀；

3）分离、纯化处理

向“两虫”富集沉淀中加入磷酸盐-吐温缓冲溶液，混匀，制成“两虫”悬浮液，接着向悬浮液中加入Percoll-蔗糖介质，进行密度梯度离心处理，离心混合液分为3层，取中间层，即得纯化的隐孢子虫和贾第鞭毛虫。

2.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤1）中所述含有藻类的水中藻类的浓度≤1×10⁸个藻类细胞/升。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征是，步骤1）中所述加压处理过程中相对压力为0.7-1.0MPa。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征是，步骤2）中所述离心处理包括如下处理步骤：

2A）将丙酮溶解-分散混合物进行离心处理，去除上清液，获得丙酮溶解-分散混合物离心沉淀物；

2B）向丙酮溶解-分散混合物离心沉淀物中加入乙醇和PBS缓冲溶液，混合后获得乙醇-PBS缓冲混合液，对乙醇-PBS缓冲混合液进行离心处理，去除上清液，获得“两虫”富集沉淀。

5.如权利要求1或2所述的方法，其特征是：步骤3）中所述磷酸盐-吐温缓冲溶液按照如下步骤制备而成：

A）按照如下用量备料（以1L水量计）

B）将上述原料加入到纯水中，搅拌溶解均匀后定容至1000mL，调节pH到7.2-7.4，制得磷酸盐缓冲溶液；

C）向磷酸盐缓冲溶液中加入吐温80，搅拌混匀，即得，其中每100mL磷酸盐缓冲溶液中加入0.01-0.2mL的吐温80。

6.如权利要求1或2所述的方法，其特征是：步骤3）中所述“两虫”富集沉淀与所述磷酸盐-吐温缓冲溶液的体积之比为1:10-30。

7.如权利要求1或2所述的方法，其特征是：步骤3）中所述Percoll-蔗糖介质的密度为1.10-1.15g/cm³。

8.如权利要求1或2所述的方法，其特征是：步骤3）中加入的Percoll-蔗糖介质与所述“两虫”悬浮液的体积之比为1:1-2.5。

9.一种含有藻类的水中“两虫”含量的测定方法，包括如下顺序进行的步骤：

1）加压处理

对含有藻类的水加压后静置，获得上清液；

2）浓缩、富集处理

首先，采用醋酸纤维滤膜对上清液进行过滤；接着将过滤后醋酸纤维滤膜和滤膜截留物加入到丙酮中，溶解，分散，获得丙酮溶解-分散混合物；然后对丙酮溶解-分散混合物进行离心处理，收集沉淀，获得“两虫”富集沉淀；

3）分离、纯化处理

向“两虫”富集沉淀中加入磷酸盐-吐温缓冲溶液，混匀，制成“两虫”悬浮液，接着向悬浮液中加入Percoll-蔗糖介质，然后进行密度梯度离心处理，离心混合液分为3层，取中间层，即得纯化的隐孢子虫和贾第鞭毛虫液；

4）染色、镜检

首先，对“两虫”纯化液进行过滤处理，接着进行染色处理，然后置于显微镜下观察，镜检计数。

10.如权利要求9所述的测定方法，其特征是：步骤1）中所述含有藻类的水中藻类的浓度≤1×10⁸个藻类细胞/升。