[发明专利]一种含有藻类的水中“两虫”的富集、纯化方法及其含量测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种水中检测技术领域的方法，具体涉及一种含有藻类的水中隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫孢囊的富集、纯化方法以及其在含藻水中含量的测定方法。

背景技术

隐孢子虫和贾第鞭毛虫（简称“两虫”）是两种寄生于人和动物体内的致病性原生动物，近年来国外出现了多次由于水中“两虫”所导致的介水疾病的暴发，其危害已经引起了广泛的重视。“两虫”作为两种重要的病原微生物已经列入《生活饮用水卫生标准》（GB5749-2006），明确规定其限值<1个/10L。

由于水中“两虫”的含量一般较低，现有对“两虫”的检测通常需要经过浓缩富集、分离纯化及染色和镜检多个检测步骤完成。其中最为常用的检测方法是采用美国的EPA1623方法（“EPA1623方法”是由美国国家环保局制定的用于测定水中隐孢子虫和贾第鞭毛虫的标准方法）。我国标准的检测方法（GB/T5750.12-2006）参照美国环保局（USEPA）制定的方法（815-R-05-002），滤囊/滤芯富集结合免疫磁分离和免疫荧光染色显微观察。然而由于专用的滤囊/滤芯以及免疫磁珠分离试剂盒，检测成本昂贵，并不利于日常检测中的规模化推广。

日本对检测环境水样中的“两虫”方法进行了改进，用膜过滤-丙酮溶解这一操作步骤优替代1623中的滤筒/滤囊过滤，避免了洗脱过程中“两虫”的流失，提高了回收率。然而在水源水中藻类浓度较高条件下，无论采用滤囊/滤芯或膜过滤的方式进行浓缩，往往需要多个滤囊/滤芯或滤膜进行，不仅操作上麻烦，而且实验耗费较大；同时由于得到过多的沉淀，不利于隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫孢囊的进一步分离纯化，导致回收率不高。但是，藻类数量繁多的情况下，特别在夏秋季，有的水源水每毫升藻类数量可达千万以上，是“两虫”的千万倍，需要通过多个滤囊/滤芯或滤膜才能完成浓缩富集，有些藻类（例如铜绿微囊藻）和“两虫”的大小、形状非常相近，后续的分离纯化难度大，容易导致回收率过低，甚至还能自发荧光，产生藻类掩蔽效应，干扰“两虫”镜检，对“两虫”含量通常较低的水源水检测造成很大干扰。因此有必要针对高藻水条件下开发一种操作方便，且成本不高的富集及分离纯化方法。

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有技术中存在的问题和不足，提供一种含有藻类的水中的隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫孢囊检测回收率的富集、分离、纯化方法及其含量的检测方法，本发明方法中“两虫”的回收率高，背景杂质干扰少，测定结果准确，同时本发明不需要昂贵的仪器设备、耗材，操作简便，达到了降低测试成本的目的。

为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种含有藻类的水中隐孢子虫和贾第鞭毛虫的富集、纯化方法，包括如下顺序进行的步骤：

1）加压处理

对含有藻类的水进行加压处理，然后静置放置，获得上清液；

2）浓缩、富集处理

首先，采用醋酸纤维滤膜对上清液进行过滤；接着将过滤后醋酸纤维滤膜和滤膜截留物加入到丙酮中，溶解、分散，获得丙酮溶解-分散混合物；然后对丙酮溶解-分散混合物进行离心处理，收集沉淀，获得“两虫”富集沉淀；

3）分离、纯化处理

向“两虫”富集沉淀中加入磷酸盐-吐温缓冲溶液，混匀，制成“两虫”悬浮液，接着向悬浮液中加入Percoll-蔗糖介质，然后进行密度梯度离心处理，离心混合液分为3层，取中间层，即得纯化的隐孢子虫和贾第鞭毛虫。

其中，步骤1）中所述含藻水中藻类的浓度≤1×10⁸个藻类细胞/升，即每1L含藻水中含有的藻类细胞的个数≤1×10⁸个藻类细胞。

特别是，所述含藻水中藻类的浓度优选为5×10⁷～1×10⁸个藻类细胞/升，即每1L含藻水中含有5×10⁷～1×10⁸个藻类细胞。

特别是，所述藻类为微囊藻。

尤其是，所述藻类为铜绿微囊藻。

其中，步骤1)中所述加压处理过程中相对压力为0.7-1.0MPa，优选为0.8-0.9MPa；加压处理时间为5-20min，优选为5-15min，进一步优选为10min。

特别是，所述静置放置处理的时间≥10min，优选为10-20min。

特别是，将含有藻类的水放置于耐压容器内，进行所述的加压处理。

尤其是，所述的耐压容器选择加压釜。

其中，步骤2）中所述离心处理包括如下处理步骤：