[发明专利]检测藕种携带莲真菌性腐败病病原菌的方法、试剂盒及引物

说明书

技术领域

本发明属于莲藕的真菌性腐败病病原菌检测技术领域，具体涉及一种检测藕种携带莲真菌性腐败病病原菌的方法、试剂盒及引物。 

背景技术

莲藕（含藕莲和籽莲）属睡莲科植物，是一种国内外广泛种植的多年生宿根草本植物。我国莲藕种植历史十分悠久，莲藕的根、茎、果均含有丰富的淀粉、蛋白质和维生素，具有很高的经济价值，是一种优良的水生蔬菜，已成为农民经济增长的重要作物之一。近年来，随着种植业结构调整，我国的莲藕种植面积有了较大幅度增加，据估计，目前全国莲藕种植面积约33万hm²以上。 

莲藕腐败病是由镰刀菌属侵染引起的一种重要土传病害。在莲藕种植过程中，藕种带菌是莲藕腐败病的主要初侵染源，该病害主要危害莲地下茎和根部，一般能够造成莲藕减产15%-40%，严重时达60%以上，甚至绝收。该病首先在受害的地下茎（藕节）出现症状，其后才逐渐在病茎生出的地上叶片和叶柄显症，由于腐败病发生的环境特殊性及叶片显症的滞后性，往往造成错过该病的防治适期，导致严重减产。而且目前，学者们对莲藕腐败病致病菌为镰刀菌属真菌多已认同，但对其种的确定却说法不一，已见报道的就有尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、珠镰刀菌（F.moniliforme）、腐皮镰刀菌（F.poae）、接骨木镰刀菌（F.sambucinum）和半裸镰刀菌（F.avenaceum）等。因此，对莲藕 腐败病病原菌的分类地位进行鉴定，进而对藕种是否携带腐败病病菌进行检测的研究是有积极意义的；如果能够通过PCR技术与测序法相结合，高效实现真菌属内不同的种之间的系统分类；进一步通过序列比对，确定莲藕腐败病的致病菌种属类群；结合测序方法，设计莲藕腐败病病原菌的特异性检测引物，实现对藕种的莲真菌性腐败病的快速检测，是能达到莲藕腐败病的早期诊断与预防目的的，具有重要实际应用价值。 

就现有技术而言，获得莲藕腐败病病原菌的分子检测引物需要克服致病菌的种类鉴定，因为莲藕腐败病的致病菌的种类还未能完全确定，本发明应用分子生物学技术对莲藕腐败病致病菌进行了种类鉴定，明确了莲藕腐败病病原菌的种属，属于尖孢镰刀菌莲专化型（F.oxysporum Schl.sp.nelumbicola(Nis.et Wat.)Booth），并根据该尖孢镰刀菌莲专化型进一步设计特异性检测引物，实现高效准确的对莲藕腐败病病原菌的分子检测。目前来说，还没有关于针对尖孢镰刀菌莲专化型设计的特异性检测引物，以及将其用于检测藕种是否携带该莲藕腐败病致病菌的方法报道或公开过。 

发明内容

本发明的目的之一是提供一种快速检测藕种携带莲真菌性腐败病病原菌的方法，尤其是特别针对于尖孢镰刀菌莲专化型致病菌的高效检测方法。 

本发明的目的之二是提供上述方法配套的试剂盒和引物。 

本发明的目的是通过以下方式实现的： 

一种检测藕种携带莲真菌性腐败病病原菌的方法： 

对藕种进行取样，提取样品基因组DNA作为模板，以 

上游引物：5’-AGGACCCCTAAACTCTGTTTCTAT-3’； 

下游引物：5’-CAGTTGCGAGGGTTTTACTACTAC-3’； 

进行PCR反应，如果扩增得到337bp的条带，则待测样品中携带有莲真菌性腐败病病原菌。 

PCR扩增反应体系中含有：2.5μL含15mM MgCl₂的10×Trans Start Buffer；2.5μL浓度为2.5mM的dNTPs；1U Trans Start Taq DNA Polymerase；2μL浓度为10mM PCR上、下游混合引物；50ng模板DNA；ddH₂O补足到25μL。 

PCR扩增反应程序为： 

阶段1：94℃预变性5min；阶段2：94℃20s，55℃20s，72℃30s，共循环34次；阶段3：72℃延伸4min；阶段4：4℃保持。 

所述的莲真菌性腐败病病原菌为尖孢镰刀菌莲专化型。 

上述方法中所述的藕种包括藕莲或籽莲的藕种。 

一种检测藕种携带莲真菌性腐败病病原菌的试剂盒：包括 

上游引物：5’-AGGACCCCTAAACTCTGTTTCTAT-3’； 

下游引物：5’-CAGTTGCGAGGGTTTTACTACTAC-3’； 

所述的莲真菌性腐败病病原菌为尖孢镰刀菌莲专化型。