[发明专利]一种简并引物及利用该简并引物检测马铃薯Y病毒属病毒的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物病毒检测技术领域，具体涉及一种简并引物及利用该简并引物检测马铃薯Y病毒属病毒的方法。

背景技术

马铃薯Y病毒属（Potyvirus）是马铃薯Y病毒科（Potyviridae）最大的一个属。根据2012年国际病毒分类委员会公布的分类标准，目前该属已报导确定种146个、暂定种32个。马铃薯Y病毒属病毒对农业生产安全可造成严重威胁，该属病毒以蚜虫的非持久性传播为主要传播途径，一般寄主范围较窄，但多数病毒分布很广；另有少数病毒具有十分广泛的寄主范围，并可造成多种作物明显减产。根据2007年公布的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，该Y病毒属中被列为检疫性病毒的种类有：马铃薯A病毒(Potato virus A, PVA)、马铃薯V病毒(Potato virus V， PVV)、李痘病毒(Plum pox virus，PPV)、香蕉苞叶花叶病毒(Banana bract mosaic virus, BBrMV)，共4种。目前尚未见到用简并引物检测马铃薯Y病毒属病毒的Touch-down PCR检测方法。

发明内容

本发明目的在于提供一种简并引物及利用该简并引物检测马铃薯Y病毒属病毒的方法。

为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

一种简并引物，其由正向引物和反向引物组成，

正向引物的核苷酸序列为：5’-GTITGYGTKGAYGAYTTYAAYAA-3’（如SEQ ID NO. 1所示）；

反向引物的核苷酸序列为：5’-GTRTGBCKYTCIGTRTYYTC-3’（如SEQ ID NO. 2所示）；其中，Y=C/T，K=G/T，R=A/G，B=G/T/C，I=次黄嘌呤。

利用上述简并引物检测马铃薯Y病毒属病毒的方法，其包括如下步骤：以样品总RNA为模板，利用上述引物进行Touch-down RT-PCR反应，反应结束后凝胶电泳检测扩增产物，根据扩增所得的DNA片段位置判定结果，阳性样品中均能检出约1700bp的DNA片段。也就是说，若在1600－1800bp位置处出现电泳条带，则判定样品中含有马铃薯Y病毒属病毒。

具体的，所述的Touch-down RT-PCR反应包括反转录和Touch-down PCR扩增两个过程。

进一步的，所述反转录的反应温度为42℃；所述Touch-down PCR扩增时，第一个循环退火温度为55℃，以后每个循环退火温度降低1℃，共进行15个循环，然后用退火温度40℃进行20个循环，延伸温度为72℃。

此外，对扩增得到的DNA片段进行序列测定后，可鉴定马铃薯Y病毒属病毒的种类。

将上述简并引物应用于马铃薯Y病毒属病毒Touch-down RT-PCR通用检测试剂盒。

本申请在现有技术基础上重新寻找马铃薯Y病毒属NIb、CP基因上的保守区域，根据保守区域序列设计一对简并引物，通过反转录(reverse transcription，RT)和Touch-down聚合酶链式反应技术(Touch-down polymerase chain reaction，Touch-down PCR)建立了马铃薯Y病毒属的通用Touch-down RT-PCR检测方法，反应结束后根据特异性扩增DNA片段的位置判定结果，并根据序列测定结果进行病毒种类鉴定。本发明设计的简并引物简并度低，并且利用Touch-down PCR，在高温时积累特异扩增，低温时对特异产物进行大量扩增，与已报道的现有方法相比，获得的条带更加单一，特异性更强。采用本发明检测方法能够快速准确地判断样品是否含有马铃薯Y病毒属病毒，引物通用性好，检测方法快速准确，为基础研究和进出口安全提供了保证。

附图说明

图l为利用本发明方法对该马铃薯Y病毒属病毒的通用性试验结果；图中，l为番木瓜环斑病毒(PRSV)病叶、2为番木瓜畸形花叶病毒(PLDMV)病叶、3为辣椒环斑病毒(ChiRSV)病叶、4为辣椒脉斑驳病毒(ChiVMV)病叶、5为甜椒脉斑驳病毒(PVMV)、6为烟草脉带花叶病毒(TVbMV)病叶、7为甘蔗花叶病毒(ScMV)病叶、8为高粱花叶病毒(SrMV)病叶、9为水茄花叶病毒(WTMV)病叶、10为茉莉花T病毒(MVT)病叶，M为2000bp的DNA Mark；