[发明专利]一种启动子及表达外源蛋白的重组表达系统

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和遗传工程技术领域，具体涉及一种启动子及表达外源蛋白的重组表达系统。

背景技术

通过基因重组技术生产有价值的外源性蛋白质是当今生物技术研究与开发的热点之一。细菌、酵母和丝状真菌具有生长快、易培养、表达量高以及分子操作简单的特点，这使得它们已广泛地开发应用于异源蛋白质的表达（张小霞等，2004，国外医学卫生学分册）。目前已有的比较成熟的细菌类表达系统有大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌、假单胞菌和克雷伯氏菌等；而真菌类表达系统有酵母类和丝状真菌类，其中酵母类有酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、多型汉逊酵母、巴斯德毕赤酵母和乳酸克鲁维酵母；而丝状真菌类有镰刀菌、木霉、黑曲霉、粗糙脉孢霉和米曲霉等。但由于受蛋白自身结构、分子大小和翻译后修饰等影响，不同表达系统中目的蛋白的表达量（活性）往往不一样，这就需要选择合适的表达系统。选择合适的表达系统往往要考虑以下因素：表达量、目的用途、筛选策略、密码偏爱性、蛋白可溶性、纯化回收、宿主的蛋白酶和修饰系统等。尤其是目的蛋白的用途是重要的考虑因素，如药物筛选要求保持蛋白天然状态，抗原蛋白仅需考虑表达量，饲用或食用蛋白需要考虑表达系统的安全性，而工业应用类则需多考虑蛋白的功能。因此，尽管很多研究机构和生物企业开发了很多表达系统；但是，每个表达系统总有其优点和缺点，任何一个表达系统不可能适合表达所有的蛋白。

下面介绍目前使用的几种表达系统：

1）大肠杆菌表达系统开发至今已超过30年、也是应用最广泛的蛋白表达系统；其优点是遗传背景清楚、繁殖快、表达量高（1-5g/l）；但是缺点也很明显，对结构复杂如二硫键的蛋白极易形成无活性的包涵体，加之胞内表达需要破碎细胞、使得下游处理工艺复杂（Jana,S.,and Deb,J.K.2005，Appl.Microbiol.Biotechnol.）。

2）德国MoBiTec公司开发了B.megaterium和B.subtilis为宿主的表达系统。芽孢杆菌宿主的优点是：公认的安全菌株、分泌表达、无明显的密码偏爱性。其缺点是：分泌大量能降解目的蛋白的胞外蛋白酶。因此，敲除芽孢杆菌的蛋白酶基因是其高效表达的关键步骤之一。

3）链霉菌是革兰氏阳性原核细菌，它具有发酵成本低，分泌水平高的特点。但是，链霉菌往往不能高水平的表达真核生物的基因。目前，报道最多的是变铅青链霉素（Steptomyces lividans）。加拿大Cangene公司利用该菌生产的巨噬细胞集落刺激因子已到III期临床水平。

4）酵母表达系统的优点是代时短、生长快，分泌表达和翻译后修饰系统；所以其表达蛋白多能正确折叠而具活性。由酵母成功表达的蛋白有3000多种，包括以用于临床的胰岛素和乙肝疫苗等。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）应用历史最悠久，广泛应用于酿酒和烘焙；也是第一个用于异源表达的酵母（Strausberg and Strausberg，2001，Curr.Protoc.Protein Sci）。S.verevisiae缺点是质粒不稳定、拷贝数低和表达蛋白的高度糖基化。目前，已开发的酵母类表达系统有很多；其中毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统应用最广最成功、蛋白表达量达77mg-20g/l不等；其表达的分子量最大蛋白是β-半乳糖苷酶（117kDa）（Cregg,J.M.，2007，Methods Mol.Biol.）。

5）丝状真菌具有很高的蛋白质分泌能力，能进行各种翻译后加工，如内含子剪切和糖基化修饰等。丝状真菌如曲霉(Aspergillus)等又是公认安全菌株（GRAS）；因此丝状真菌表达生产外源蛋白已经广泛用于工业酶的生产（唐国敏，1992，真菌学报；吴其威，1993，生命科学）。已成功工业化开发的丝状真菌表达系统有里氏木霉表达系统，黑曲霉表达系统和米曲霉表达系统等。

尽管上述表达系统已广泛应用于工业生产中，但仍然不能满足工业上对于成本降低的需要，此外，还有很多蛋白因为没有合适的表达系统，无法实现放大生产和应用，因此开发新型的表达系统，寻找更多、更高效的表达外源蛋白的方法，一直是本领域技术人员的研究热点和难点。

发明内容