[发明专利]一种布舍瑞林的纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种布舍瑞林的纯化方法。具体而言，本发明涉及一种操作简单、高收率、纯度高、有利于实现产业化的布舍瑞林的纯化方法。

背景技术

布舍瑞林是一种化学合成的由9个氨基酸组成的多肽，为天然促性腺激素释放激素的类似物。具体地，布舍瑞林为天然促性腺激素释放激素氨基酸序列第6位的甘氨酸被D-丝氨酸取代，10位的甘氨酰胺被乙酰胺（ethylamide）替换后得到的产物，其作用与天然促性腺激素释放激素相比大大增强，其对黄体生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH），放的影响是促性腺激素释放激素（LHRH）的20-170倍。主要用于晚期前列腺癌（D期）的姑息疗法（缓解无法治愈患者的疼痛和症状）。

目前关于布舍瑞林的文献主要为合成方面的，涉及到纯化方面的很少。中国申请CN201010039548.9是采用反相色谱纯化布舍瑞林，但其得到的产品纯度不高，仅有98%左右，单个杂质也有1.46%，不能满足药品申报的要求。

本发明的目的是提供一种操作简单、高收率、纯度高、有利于实现产业化的布舍瑞林的纯化方法。本发明产品的纯度可达99.0%以上，单个杂质不大于0.1%，纯化收率可达80%以上。且可以实现规模化生产，单批次产量可达200克以上。可大幅提高产品的质量和降低成本。

发明内容

为实现上述目的，综合考虑布舍瑞林本身的性质，本发明提供了一种布舍瑞林的纯化方法，包括以下步骤：

—以体积比5%—30%的甲醇的水溶液溶解粗肽，得到粗肽溶液；

—将所得粗肽溶液进行色谱法梯度洗脱纯化，以体积比0.1%—0.4%的硫酸和体积比0.1%—0.4%高氯酸的水溶液用三乙胺调pH值5.5—6.5后的溶液为A相，乙腈为B相，梯度：B%：10%—40%洗脱，收集纯化的布舍瑞林硫酸盐溶液；

—用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱上采用反相高效液相色谱法将梯度洗脱后的样品转盐和脱盐，以0.1～0.6%（w/v）的醋酸铵水溶液为A相，乙腈为B相，梯度：B%：3%～10%梯度或等度冲洗15～30分钟后。然后用醋酸水溶液乙腈体系脱盐处理。

具体而言，本发明提出了一种布舍瑞林醋酸盐的纯化方法，纯度高且收率好，达到产业化要求。

在一个实施方案中，本发明提供的一种布舍瑞林醋酸盐的纯化方法包括以下步骤：

步骤1）：以5—30体积%的甲醇的水溶液按照浓度20g/L—50g/L溶解粗肽，用水将粗肽溶液中甲醇的体积比例稀释到20%以下。步骤1）下文也表述为“前处理”。

所述“粗肽”是指采用液相合成法或固相合成法得到的，尚未经过精制处理的布舍瑞林粗肽或者纯度不能满足药用的布舍瑞林，粗肽中布舍瑞林的纯度在20%以上，采用例如中国申请CN201010039548.9的方法较难实现该浓度产品的高纯度纯化。

“粗肽溶液”是指粗肽经过前处理后所得到的溶液，所使用的水为纯净水，并符合注射用水标准，优选超纯水；所使用的醋酸为分析纯的冰醋酸，本发明的“乙腈”的纯度级别优选色谱纯。

选择体积比5%—30%的甲醇水溶液混合溶剂系统是通过对比试验考虑实际生产过程的操作方便得出的，不在该浓度的溶剂的溶解能力会变低，导致溶解样品所需的溶解体积过大，不利于反相色谱的处理（会导致体积过载，纯化效率低）。

将制备的粗肽的浓度控制在20g/L—50g/L有利于纯化效率，高于50g/L会导致后续的反相色谱纯化时不挂色谱柱，低于20g/L会使纯化效率低下。

用水将所得粗肽溶液中的甲醇的体积比例稀释到20%以下，当甲醇的比例高于20%此范围的溶剂会导致后续的反相色谱纯化时不挂色谱柱，以至于反相色谱纯化无法进行。

步骤2）：将所得粗肽溶液进行色谱法梯度洗脱纯化，以0.1%—0.4%的硫酸和0.1%—0.4%高氯酸水溶液（体积比，用三乙胺调pH值5.5—6.5，优选6.0）为A相，乙腈为B相，梯度：B%：10%—40%，收集纯化的布舍瑞林硫酸盐溶液；步骤2）下文也表述为“纯化”。

选择0.1%—0.4%的硫酸和0.1%—0.4%高氯酸两种酸用氨水调节后生成两种缓冲盐的A相是优化选择的结果，与中国申请CN200910126363采用0.1%TFA的方法相比具有更好的分离效果。流动相A中缓冲盐的浓度低于所限定的范围使流动相缓冲能力变弱，导致样品不能完全洗脱且谱图变形达不到分离的要求。大于此范围，流动相A中缓冲盐的浓度过高对色谱系统损伤较大，甚至会部分产生盐析，导致无法纯化。另外，流动相A的pH值也非常重要，不在5.5—6.5范围达不到分离效果。