[发明专利]紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC3及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC3及其应用。

背景技术

NAC转录因子(包括NAM、ATAF1/2和CUC2)是植物特有的一种具有多种调控作用的转录因子，广泛存在与陆生植物中，这类转录因子的主要结构特点是N端为保守的大约150个氨基酸残基的NAC结构域，可以结合DNA和其他蛋白，可以分成从A～E5个保守区；C端则为高度多样性的转录激活调控区，富含丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、谷氨酸等，研究发现有些NAC蛋白的C-端具有蛋白结合活性。目前已有研究表明NAC家族的一些成员在逆境应答网络中起作用。拟南芥中ANAC019、ANAC055和ANAC072受到干旱、高盐以及脱落酸(ABA)的诱导表达，它们能显著提高植株的耐旱能力(Tran et al.,2004)。拟南芥LOV1基因能增强植株的抗冻能力(Yoo et al.,2007)。来自水稻的SNAC1/2(stress-responsive NAC2)基因受到干旱、高盐、低温、伤以及ABA的诱导表达，其过表达植株耐冷、抗盐并能抵御干旱(Hu et al.,2008)。过量表达OsNAC6基因的水稻虽然生长慢、产量低，但却显示出对干旱、高盐以及枯萎病的较强抗性(Nakashima et al.,2007)。尽管NAC基因的功能还有待深入研究，但它们在植物遗传工程方面已展现出了巨大的应用潜力。

发明内容

本发明的目的是提供紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC3及其应用。

本发明提供紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC3，其具有：

1）SEQ ID No.11所示的核苷酸序列；或

2）SEQ ID No.11所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或

3）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

本发明提供了含有上述基因MsNAC3的表达载体。

在本发明的一个实施例中，得到的含有基因MsNAC3的表达载体为pBIGFP-MsNAC3。

该表达载体的构建方法为：以紫花苜蓿叶的总RNA反转录得到的cDNA为模板，进行PCR反应，上游引物序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物序列如SEQ ID NO.8所示；

将RT-PCR扩增产物回收后连接在pMD18-T载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，选取阳性克隆进行测序，用XbaI和KpnI进行双酶切，回收目的片段，连接到含有eGFP植物表达载体pBIGFP的XbaI和KpnI位点中，构建得到pBIGFP-MsNAC3。

含有上述表达载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了含有基因MsNAC3的转化植物细胞。

本发明提供了MsNAC3基因在制备转基因植物中的应用。

优选地，所述的植物为拟南芥、烟草、洋葱、水稻、小麦、玉米、苜蓿、大豆或棉花。

本发明提供了MsNAC3基因在提高植物抗逆性方面的应用。

所述的抗逆性是指抗寒、抗旱或耐盐性。

本发明还提供了克隆紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC3的方法，包括以下步骤：

（1）以紫花苜蓿总RNA为模板，反转录合成cDNA第一链；

（2）以步骤（1）的cDNA为模板进行PCR，回收产物，测序正确的为紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC3。

其中，步骤（1）将紫花苜蓿幼苗放于4℃进行冷胁迫处理之后，取提取紫花苜蓿总RNA，以总RNA为模板，反转合成cDNA第一链。

其中，步骤（2）的PCR方法中，所用引物序列中上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游序列如SEQ ID NO.2所示。

步骤（2）的PCR反应程序为94℃3min；94℃10s，55℃20s，72℃1min，31个循环；72℃10min。