[发明专利]构建HIV病毒抗体酵母展示库的方法和筛选病毒广谱中和性抗体的方法及其应用

权利要求书

1.一种筛选病毒广谱中和性抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）制备或提供病毒抗原蛋白；

（2）采用荧光标记物对所述病毒抗原蛋白进行标记；

（3）制备病毒阳性病人的cDNA模板，设计引物，扩增抗体基因；

（4）采用所得抗体基因构建酵母抗体展示库；

（5）取所得抗体展示库中的酵母细胞与步骤（2）所得具有荧光标记物的病毒抗原蛋白混合孵育，然后设定细胞分离门，采用流式细胞仪分选荧光阳性的酵母细胞；

（6）对所得荧光阳性的酵母细胞进行测序鉴定，得到病毒广谱中和性抗体。

2.如权利要求1所述的一种筛选病毒广谱中和性抗体的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述病毒抗原蛋白为HIV-1型病毒的抗原蛋白。

3.如权利要求2所述的一种筛选病毒广谱中和性抗体的方法，其特征在于，所述HIV-1型病毒的抗原蛋白为HIV-1型病毒的gp41抗原蛋白、gp120抗原蛋白和gp160抗原蛋白中的一种或多种。

4.如权利要求1所述的一种筛选病毒广谱中和性抗体的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，所述采用荧光标记物对所述病毒抗原蛋白进行标记的步骤为采用不同的荧光标记物对不同的所述病毒抗原蛋白分别进行标记。

5.如权利要求1所述的一种筛选病毒广谱中和性抗体的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，所述制备病毒阳性病人的cDNA模板的步骤包括：制备HIV-1阳性病人外周血单个核淋巴细胞PBMC，提取总RNA，以随机六聚体为引物反转录合成cDNA；

所述设计引物的步骤包括:

a、合成第一轮PCR引物

包括VH上游引物、VH下游引物、VL上游引物、VL下游引物，各引物不含酶切位点和linker序列；

b、合成第二轮PCR引物

将每条第一轮PCR引物的5’端加上linker序列，得到第二轮PCR引物，其中，加在VH的上游引物和VL的下游引物的5’端的linker序列中各有一个SfiⅠ酶切位点，加在VH的下游引物和VL的上游引物的5’端的linker序列反向互补；

所述扩增抗体基因的步骤包括:

S01、多重PCR扩增抗体重链：

以所得cDNA为模板，取第一轮PCR引物的重链下游引物等摩尔混合，再分别与重链上游引物进行多重PCR，得到第一轮重链PCR产物；然后以第二轮PCR引物的重链上游引物等摩尔混合，再分别与重链下游引物进行第二轮多重PCR，得到第二轮重链PCR产物；

S02、多重PCR扩增抗体轻链：

以所得cDNA为模板，取第一轮PCR引物的轻链下游引物等摩尔混合，再分别与轻链上游引物进行多重PCR，得到第一轮轻链PCR产物；然后以第二轮PCR引物的轻链上游引物等摩尔混合，再分别与轻链下游引物进行第二轮多重PCR，得到第二轮轻链PCR产物；

S03、将步骤S01所得的第二轮重链PCR产物和S02所得的第二轮轻链PCR产物混合进行重叠PCR，得到抗体基因。

6.如权利要求1所述的一种筛选病毒广谱中和性抗体的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，所述酵母抗体展示库为啤酒酵母抗体展示库。

7.如权利要求1所述的一种筛选病毒广谱中和性抗体的方法，其特征在于，所述步骤（5）中，所述设定细胞分离门，采用流式细胞仪分选荧光阳性的酵母细胞的步骤重复3～4次。