[发明专利]构建HIV病毒抗体酵母展示库的方法和筛选病毒广谱中和性抗体的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体涉及一种构建HIV病毒抗体酵母展示库的方法和筛选病毒广谱中和性抗体的方法及其应用。 

背景技术

广谱病毒中和抗体是感染病人获得性免疫球蛋白，此类抗体广谱的与病毒颗粒结合，阻止其进一步感染人体细胞，可导致病毒颗粒裂解，进而引起“中和”反应。尤其在易突变的病毒，譬如HIV治疗中及其重要。目前筛选病毒广谱中和抗体，多利用病人外周血单个核淋巴细胞PBMC细胞，进行抗体DNA的扩增，利用噬菌体展示进行顺次反复筛选，建立噬菌体展示的抗体库。 

但是，由于中和性抗体的比例小，且极其稀有，若筛选压力不足，很难从10⁸-10⁹库容量的库中获得阳性克隆，假阳性高。若筛选压力过大，容易丢失亲和力低但中和性强的抗体株。因此，噬菌体筛选的缺点是假阳性率高，且筛选过程不易控制，容易造成有效克隆丢失。 

因此有必要提供一种高效、假阳性率低、且筛选过程可控的筛选病毒广谱中和性抗体的方法。 

发明内容

为解决上述问题，本发明第一方面提供了一种筛选病毒广谱中和性抗体的方法，该方法通过构建酵母抗体展示库，采用荧光标记的病毒抗原蛋白，结合流式细胞仪分选技术筛选病毒广谱中和性抗体，该流式分选过程为可视化筛选，通过设置细胞分离门，提高了筛选过程的可控性，避免了常规筛选带来的假阳 性过高问题。本发明第二方面提供了一种筛选病毒广谱中和性抗体的方法的应用。本发明第三方面提供了一种构建HIV病毒抗体酵母展示库的方法。本发明第四方面提供了一种构建HIV病毒抗体酵母展示库的方法的应用。 

本发明所述“单个核淋巴细胞”是指以淋巴细胞为主的细胞群体，其中含有少量的单核细胞。VH代表抗体重链，VL代表抗体轻链。 

第一方面，本发明提供了一种筛选病毒广谱中和性抗体的方法，包括如下步骤： 

（1）提供病毒抗原蛋白； 

（2）采用荧光标记物对所述病毒抗原蛋白进行标记； 

（3）制备病毒阳性病人的cDNA模板，设计引物，扩增抗体基因； 

（4）采用所得抗体基因构建酵母抗体展示库； 

（5）取所得抗体展示库中的酵母细胞与步骤（2）所得具有荧光标记物的病毒抗原蛋白混合孵育，然后设定细胞分离门，采用流式细胞仪分选荧光阳性的酵母细胞； 

（6）对所得荧光阳性的酵母细胞进行测序鉴定，得到病毒广谱中和性抗体。 

优选地，所述步骤（1）中，所述病毒抗原蛋白为HIV-1型病毒的抗原蛋白。 

进一步优选地，所述HIV-1型病毒为HIV-1病毒A、B、B′、C、D、G和F亚型中的至少一种。 

进一步优选地，3、4、所述HIV-1型病毒的抗原蛋白为HIV-1型病毒的gp41抗原蛋白、gp120抗原蛋白和gp160抗原蛋白中的一种或多种。 

优选地，所述步骤（2）中，所述采用荧光标记物对所述病毒抗原蛋白进行标记的步骤为采用不同的荧光标记物对不同的所述病毒抗原蛋白分别进行标记。 

进一步优选地，所述不同的荧光标记物为Alexa Fluor488、Alexa Fluor555和Alexa Fluor 647中的一种或多种。 

优选地，所述步骤（3）中，所述制备病毒阳性病人的cDNA模板的步骤为： 制备或提供HIV-1阳性病人外周血单个核淋巴细胞PBMC，提取总RNA，以随机六聚体为引物反转录合成cDNA。 

所述设计引物的步骤包括: 

a、合成第一轮PCR引物 

包括VH上游引物、VH下游引物、VL上游引物、VL下游引物，各引物不含酶切位点和linker序列； 

b、合成第二轮PCR引物 

将每条第一轮PCR引物的5’端加上linker序列，得到第二轮PCR引物，其中，加在VH的上游引物和VL的下游引物的5’端的linker序列中各有一个SfiⅠ酶切位点，加在VH的下游引物和VL的上游引物的5’端的linker序列反向互补； 

所述扩增抗体基因的步骤包括: 

S01、多重PCR扩增抗体重链： 

以所得cDNA为模板，取第一轮PCR引物的重链下游引物等摩尔混合，再分别与重链上游引物进行多重PCR，得到第一轮重链PCR产物；然后以第二轮PCR引物的重链上游引物等摩尔混合，再分别与重链下游引物进行第二轮多重PCR，得到第二轮重链PCR产物；