[发明专利]一种烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法

权利要求书

1.一种烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法，其特征在于：包括制备载体、收集菌株、制备烟曲霉生物膜载体、阿利新蓝刚果红染色方法和菌株观察方法，具体检测步骤如下：

1）制备载体 将直径为10~15 mm玻璃细胞爬片进行灭菌，作为载体；

2）收集菌株 将烟曲霉经过96孔板造膜，以结晶紫半定量法筛选出成膜能力最强的菌株，作为试验菌株；

3）制备烟曲霉生物膜载体 将步骤2）获得的菌株接种在马铃薯葡萄糖琼脂平皿上，置于35~37℃培养箱培养活化3~5天，用5~10ml含有吐温20的磷酸盐缓冲液冲洗平皿表面收集孢子，用20~25ml MOPS缓冲的RPMI-1640重悬孢子，用血细胞计数板调整孢子浓度，并用RPMI-1640液体培养液调整浓度为1~5×10⁵·孢子·ml^-1，将1~2ml孢子悬液加入步骤1）制备的玻璃细胞爬片上，玻璃细胞爬片置于无菌24孔板的孔内，每孔放一个，静置于35~37℃生化培养箱中培养；

4）阿利新蓝刚果红染色方法  

A：制备阿利新蓝和刚果红染液，将2~5g阿利新蓝、97~100ml无菌双蒸水和3~5ml冰乙酸置于容器中，并不断搅拌至阿利新蓝颗粒完全溶解，得阿利新蓝染液；将1.5~3g刚果红和95~105ml无菌双蒸水置于容器中，并不断搅拌至刚果红颗粒完全溶解，得刚果红染液；

B：用无菌磷酸盐缓冲液漂洗步骤3）制备的烟曲霉生物膜载体，去除浮游菌；

C：将步骤A获得的15~20μl阿利新蓝染液滴加到步骤B漂洗干净的烟曲霉生物膜载体上，并晃动载体使染液均匀涂布，静置5~10min；

D：将步骤C染色的烟曲霉生物膜载体用红外高温灭菌器加热，待染液干燥并固定；

E：将步骤A获得的15~20μl刚果红染液滴加到步骤D固定的烟曲霉生物膜载体上，并晃动载体使染液均匀涂布，静置5~10min；

F：将步骤E染色的烟曲霉生物膜载体在用红外高温灭菌器加热，待染液干燥并固定；

G：将步骤F获得的载体用无菌磷酸盐缓冲液漂洗，洗掉未粘附的多余的染液，直至洗脱液无色为止；

5）菌株观察方法

将步骤3）制备的烟曲霉生物膜载体于8、12、16、20、24、48h取出，每次取2~10个，并按步骤4）进行染色，在普通光镜下放大200倍观察，观察菌株变化。

2.根据权利要求1所述的烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法，其特征在于：所述步骤3）制备的烟曲霉生物膜载体静置于35~37℃生化培养箱中培养48~50h，间隔24h用MOPS缓冲的RPMI-1640换液。

3.根据权利要求1所述的烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法，其特征在于：所述步骤4）中D用红外高温灭菌器加热，距红外高温灭菌器3~5cm，待染液干燥并固定，让其自然冷却至室温，再滴加刚果红染液。

4.根据权利要求1所述的烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法，其特征在于：所述步骤4）红外高温灭菌器保持温度在650~700℃。

5.根据权利要求1所述的烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法，其特征在于：所述的阿利新蓝为2~3g，无菌双蒸水为97~99ml，冰乙酸3~4ml。

6.根据权利要求1所述的烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法，其特征在于：所述的刚果红为1.5~2g，无菌双蒸水为95~100ml。

7.根据权利要求1所述的烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法，其特征在于：所述的烟曲霉生物膜载体滴加阿利新蓝染液的量为18~20μl，静置时间5~8min。

8.根据权利要求1所述的烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法，其特征在于：所述的烟曲霉生物膜载体滴加刚果红染液的量为18~20μl，静置7~10min。