[发明专利]一种烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及以一种用阿利新蓝刚果红染色法检测烟曲霉生物膜胞外多糖的方法。

背景技术

近年来随着恶性肿瘤、HIV、器官移植等患者增加，烟曲霉感染呈现出快速发展趋势，感染率仅次于白色念珠菌，成为免疫低下患者主要的死亡原因。烟曲霉导致的侵袭性曲霉病（invasive aspergillosis, IA）死亡率达到30-100%，耐药是导致治疗失败的一个重要原因，一项临床研究检测了1385个IA患者的烟曲霉株，发现对唑类耐药的IA患者死亡率达88%，而敏感菌株感染者死亡率为48%。体内外研究发现烟曲霉能形成生物膜，它不但可以在植入的外源性生物材料如人工心脏瓣膜、静脉插管、导尿管等表面生成，还可以在肺部空洞和支气管上皮直接形成。生物膜状态的烟曲霉不仅能形成持续的感染源造成慢性感染，而且还能作为天然屏障抵御抗真菌药，逃避机体免疫，使烟曲霉的耐药性提高几十至几百倍。鉴于生物膜作为烟曲霉耐药的重要机制，国内外对烟曲霉生物膜的研究日益重视。

研究发现70%-80%的烟曲霉能形成生物膜，而烟曲霉生物膜引起的感染与浮游状态烟曲霉引起的感染的治疗策略是不相同的，因此临床上需要通过检测烟曲霉是否形成生物膜来决定治疗策略。另外，科学实验研究也时常需要反复对生物膜的变化情况进行观测，但是目前公认而常用的形态学观察方法如扫描电镜(scanning electron microscope, SEM)和激光共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscrope, CLSM)都存在仪器设备要求高，价格昂贵，扫描电镜检测样品流程要经过取材-漂洗-固定-漂洗-后固定-脱水-干燥-镀膜-扫描等繁琐的步骤，不易普及并难以在临床上推广，因而寻找到一种快速简便可靠的真菌生物膜形态学观察方法有重要的意义。王源等人首先发现阿利新蓝刚果红染色能运用于细菌胞外糖染色，如今此方法已经在细菌生物膜研究中得到广泛运用，但是由于细菌和真菌特点不同，它们所形成的生物膜特性也不完全相同，阿利新蓝刚果红染色法能否运用于烟曲霉生物膜的胞外多糖染色未见报道。临床上急需一种快速准确检测真菌生物膜形态学的方法，这已成为限制真菌生物膜检测进一步发展的一大难题。

发明内容

本发明的目是提供一种快速、简便、可靠的真菌生物膜形态学检测方法，提供一种烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法，包括制备载体、收集菌株、制备烟曲霉生物膜载体、阿利新蓝刚果红染色方法和菌株观察方法，具体检测步骤如下：

1）制备载体 将直径为10~15 mm玻璃细胞爬片进行灭菌，作为载体；

2）收集菌株 将烟曲霉经过96孔板造膜，以结晶紫半定量法筛选出成膜能力最强的菌株，作为试验菌株；

3）制备烟曲霉生物膜载体 将步骤2）获得的菌株接种在马铃薯葡萄糖琼脂平皿上，置于35~37℃培养箱培养活化3~5天，用5~10ml含有吐温20的磷酸盐缓冲液冲洗平皿表面收集孢子，用20~25ml MOPS缓冲的RPMI-1640重悬孢子，用血细胞计数板调整孢子浓度，并用RPMI-1640液体培养液调整浓度为1~5×10⁵·孢子·ml^-1，将1~2ml孢子悬液加入步骤1）制备的玻璃细胞爬片上，玻璃细胞爬片置于无菌24孔板的孔内，每孔放一个，静置于35~37℃生化培养箱中孵育；

4）阿利新蓝刚果红染色方法  

A：配制阿利新蓝和刚果红染液，将2~5g阿利新蓝、97~100ml无菌双蒸水和3~5ml冰乙酸置于烧杯中，并不断搅拌至阿利新蓝颗粒完全溶解，得阿利新蓝染液；将1.5~3g刚果红和95~105ml无菌双蒸水置于烧杯中，并不断搅拌至刚果红颗粒完全溶解，得刚果红染液；

B：用无菌磷酸盐缓冲液轻轻漂洗步骤3）制备的烟曲霉生物膜载体，去除浮游菌；

C：将步骤A获得的15~20μl阿利新蓝染液滴加到步骤B漂洗干净的烟曲霉生物膜载体上，并轻轻晃动载体使染液均匀涂布，静置5~10min；

D：将步骤C染色的烟曲霉生物膜载体用红外高温灭菌器加热，距离红外高温灭菌器3-5cm，使染液彻底干燥并固定；

E：将步骤A获得的15~20μl刚果红染液滴加到步骤D固定的烟曲霉生物膜载体上，并轻轻晃动载体使染液均匀涂布，静置5~10min；

F：将步骤E染色的烟曲霉生物膜载体用红外高温灭菌器加热，距离红外高温灭菌器3-5cm，使染液干燥并固定；