[发明专利]一种生产柠檬酸的菌株及其发酵制备柠檬酸的方法

权利要求书

1.一种生产柠檬酸的菌株，其特征在于，其分类命名为黑曲霉（Aspergillus niger），已于2013年10月18日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CGMCC No.8368。

2.一种权利要求1所述菌株的获取方法，其特征在于，具体步骤如下：

（1）菌种分离纯化：以黑曲霉（Aspergillus niger,保藏号CGMCC NO.6465）作为出发菌株，将其稀释分离，涂布到平板培养基上，于36℃±1℃培养36～48h；

（2）菌种的扩大培养：将步骤（1）分离纯化后的单菌落分别接种于试管斜面培养基，于36℃±1℃培养4～6d；

（3）菌种发酵培养：将步骤（2）中试管斜面培养好的单菌落用接种环勾取1～2环成熟孢子接入发酵摇瓶，于36℃±1℃，摇床转速300～350rpm/min，培养80～100h;

（4）初筛：将步骤（3）摇瓶发酵液过滤，用NaOH对滤液进行滴定，通过测得发酵液产酸水平，初筛柠檬酸产量高的菌株进行复筛;

（5）复筛：将步骤（4）筛选出的菌株重复步骤（1）～（4）的过程，直至筛选得到产酸量达到14%的菌株。

3.根据权利要求2所述的获取方法，其特征在于，步骤（1）中所述平板培养基和步骤（2）所述斜面培养基均为PDA土豆培养基，其质量百分数组分为：土豆汁10%～15%、葡萄糖1%～5%、琼脂1.5%～2.5%，由柠檬酸生产的中和废水配制。

4.根据权利要求3所述的获取方法，其特征在于，所述中和废水为钙盐法提取柠檬酸发酵工艺中，柠檬酸发酵液经过板框压滤进入中和工段进行中和反应后所产生的中和废水，其中含有：Ca离子200～500ppm、K离子600～1000ppm、Mg离子100～200ppm、Fe离子10～30ppm、Na离子30～60ppm、Zn离子10～30ppm、硫酸根离子200～500ppm、氯离子30～60ppm、NH₄离子10～40ppm，pH为4.5～5.5。

5.根据权利要求2所述的获取方法，其特征在于，在步骤（3）中，所述发酵培养基是由淀粉质原料调浆至粉浆比15-30%，加入α-淀粉酶，经液化，过滤，以滤液为基料，利用柠檬酸中和废水配制总糖含量为0.13g/ml～0.18g/ml的培养基。

6.根据权利要求5所述的获取方法，其特征在于，所述淀粉质原料包括玉米、木薯或高粱中一种或两种以上。

7.一种权利要求1所述菌株生产柠檬酸的方法，其特征在于，包括步骤如下：

（1）扩大培养：将上述权利要求1-6任一所述菌株接入传代试管斜面进行第一次扩大培养，培养条件为36℃±1℃，培养时间4～6d；将培养好的斜面孢子接入麸曲瓶进行第二次扩大培养，培养条件为36℃±1℃，培养时间5～8d；

（2）孢子悬液的制备：将步骤（1）培养好的孢子冲洗配成悬浮液，每克麸曲所含孢子数为2×10¹⁰～5×10¹⁰，无菌条件下将孢子悬液倒入钢瓶备用；

（3）种子罐培养：将步骤（2）中所得到的孢子悬液接入柠檬酸种子罐进行培养，培养条件为：36℃±1℃、通风比为1:0.6～1.2、罐压0.3～0.6MPa、搅拌转速100～400rpm/min，培养周期为18～30h；

（4）发酵罐培养：将步骤（3）种子液按接种量5-10%接入发酵罐进行发酵培养，培养条件为：36℃±1℃、通风比为1:0.6～1.2、罐压0.3～0.6MPa、搅拌转速80～500rpm/min，培养周期为72～96h。

8.根据权利要求7上述方法，其特征在于，所述种子罐培养基是先将淀粉质原料调浆至粉浆比为15%～30%，加入α-淀粉酶液化，再利用柠檬酸制备过程中的中和废水配制成培养基；

所述发酵罐培养基是先将淀粉质原料调浆至粉浆比为15%～30%，加入α-淀粉酶液化，经液化，过滤，再以所得滤液为基料，利用柠檬酸制备过程中的中和废水配制成培养基。

9.根据权利要求8上述方法，其特征在于，所述淀粉质原料选自玉米、木薯或高粱中一种或两种以上。

10.根据权利要求7上述方法，其特征在于，所述种子罐培养基中总糖含量为0.05～0.1g/mL；发酵罐培养基中总糖含量为0.12～0.20g/mL。