[发明专利]一种生产柠檬酸的菌株及其发酵制备柠檬酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生产柠檬酸的菌株及其发酵制备柠檬酸的方法，属于发酵工程领域。

背景技术

柠檬酸是有机酸中第一大酸，由于物理、化学等方面的优异性能，广泛应用于医药、化学、电子、纺织、石油、皮革、建筑、摄影、塑料、铸造和陶瓷等工业领域。

现有技术中，柠檬酸普遍采用钙盐提取法从柠檬酸发酵液中获得。然而，由于柠檬酸生产工艺固有的特点，生产过程中产生的高浓度废水巳成为该行业发展的制约因素。柠檬酸生产过程排放的高浓度废水主要来自中和、洗糖以及离子交换剂再生工段，其中中和废水排放量最大。行业统计数据表明，每生产1吨柠檬酸，中和废水的排放量达10-15m³，这给环境带来污染，并提高了环保费用。因此，如何利用这些中和废水，成为目前柠檬酸生产企业急需解决问题之一。

目前，柠檬酸中和废水的回收利用主要采取碱沉淀和酸中和预处理措施后，直接用于发酵配料。但其中色素物质脱除难度大，成本高，其结果始终不是十分理想，因此，寻找一种简单方便，成本低廉的柠檬酸中和废水利用方法，对柠檬酸企业具有重要现实意义。

发明内容

本发明的目的是通过对现有黑曲霉进行驯化，获得一种更耐柠檬酸中和废水的新的菌株，并利用该菌株发酵生产柠檬酸。

为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案。

一种生产柠檬酸的菌株，其分类命名为黑曲霉（Aspergillus niger），已于2013年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.8368。

本发明还提供了上述生产柠檬酸的菌株的筛选方法，具体步骤如下：

（1）菌种分离纯化：以黑曲霉（Aspergillus niger,保藏号CGMCC NO.6465）作为出发菌株，将其稀释分离，涂布到平板培养基上，于36℃±1℃培养36～48h；

（2）菌种的扩大培养：将步骤（1）分离纯化后的单菌落分别接种于试管斜面培养基，于36℃±1℃培养4～6d；

（3）菌种发酵培养：将步骤（2）中试管斜面培养好的单菌落用接种环勾取1～2环成熟孢子接入发酵摇瓶，于36℃±1℃，摇床转速300～350rpm/min，培养80～100h;

（4）初筛：将步骤（3）摇瓶发酵液过滤，用0.1429mol/l的NaOH对滤液进行滴定，通过测得发酵液产酸水平，初筛柠檬酸产量高的菌株进行复筛;

（5）复筛：将步骤（4）筛选出的菌株重复步骤（1）～（4）的过程，直至筛选得到产酸量达到14%的菌株。

在上述筛选方法中，步骤（1）所述平板培养基和步骤（2）所述斜面培养基均为PDA土豆培养基，其质量百分数组分为：土豆汁10%～15%、葡萄糖1%～5%、琼脂1.5%～2.5%，且使用未经任何处理过的中和废水配制。

本发明所述中和废水为钙盐法提取柠檬酸发酵工艺中，柠檬酸发酵液经过板框压滤进入中和工段进行中和反应后所产生的中和废水，其中含有：Ca离子200～500ppm、K离子600～1000ppm、Mg离子100～200ppm、Fe离子10～30ppm、Na离子30～60ppm、Zn离子10～30ppm、硫酸根离子200～500ppm、氯离子30～60ppm、NH₄离子10～40ppm；以及少量的柠檬酸和无机氮源，pH为4.5～5.5。

在步骤（3）中，所述发酵培养基是由淀粉质原料调浆至粉浆比15-30%，加入α-淀粉酶，经液化，过滤，以滤液为基料，利用柠檬酸中和废水配制总糖含量为0.13g/ml～0.18g/ml的培养基；

其中，所述淀粉质原料包括玉米、木薯或高粱中一种或两种以上。为了获得更好的菌株，还可以在发酵培养基中添加常规氮源，所述氮源优选为无机氮源，如硫酸铵和或尿素等。

经过上述方法获取的菌株能够对中和废水产生足够的耐受力而不影响柠檬酸产量。

本发明还提供了上述生产柠檬酸的菌株生产柠檬酸的方法，具体步骤如下：

（1）扩大培养：将上述方法获得的菌株接入传代试管斜面进行第一次扩大培养，培养条件为36℃±1℃，培养时间4～6d；将培养好的斜面孢子接入麸曲瓶进行第二次扩大培养，培养条件为36℃±1℃，培养时间5～8d；

（2）孢子悬液的制备：将步骤（1）培养好的孢子冲洗配成悬浮液，每克麸曲所含孢子数为2×10¹⁰～5×10¹⁰，无菌条件下将孢子悬液倒入钢瓶备用；