[发明专利]一种高效提取厌氧颗粒污泥微生物总RNA的方法

权利要求书

1.一种提取厌氧颗粒污泥微生物总RNA的方法，包括下列步骤：

1）取活性污泥于灭菌离心管中离心；

2）弃上清，然后向离心管内加入灭菌玻璃珠和贮存液Ⅰ，将离心管管盖拧紧后置于旋涡混合器击打3～8min以解絮凝并洗涤污泥除去腐殖酸，离心；

3）弃上清，重复步骤2）处理1次后，用磷酸盐缓冲液PBS洗涤污泥1次；

4）取步骤3）预处理后的污泥，加入贮存液Ⅱ于30～40℃温育5～15min；

5）加入TRIzol，漩涡振荡3～8min后，离心；

6）取上清，加入氯仿，漩涡振荡10～20s后，室温放置1～4min并离心；

7）取上清，加入异丙醇，－20℃放置15～25min，离心；

8）弃上清，加入75％乙醇洗涤沉淀后，9000～11000r/min离心3～8min；

9）弃上清，风干沉淀，用贮存液Ⅲ溶解核酸沉淀后，加入DNase I(RNase free)25～35U和RNase抑制剂35～40U，并于30～40℃作用10～20min，进一步采用RNA纯化试剂盒纯化RNA。

2.如权利要求1所述的提取厌氧颗粒污泥微生物总RNA的方法，其特征在于，步骤1）和2）所述离心为，7000～9000r/min，3～8℃条件下离心3～8min。

3.如权利要求1所述的提取厌氧颗粒污泥微生物总RNA的方法，其特征在于，步骤2）所述灭菌玻璃珠的直径为2～3mm，灭菌玻璃珠的加入量为0.2～0.4g/ml活性污泥；贮存液Ⅰ的加入量为1～2mL/ml活性污泥。

4.如权利要求1所述的提取厌氧颗粒污泥微生物总RNA的方法，其特征在于，步骤3）中，将离心管管盖拧紧后置于旋涡混合器击打5min以解絮凝并洗涤污泥除去腐殖酸，步骤4）中贮存液Ⅱ的加入量为100μL/100μL预处理后的污泥；步骤4）中于37℃温育10min。

5.如权利要求1所述的提取厌氧颗粒污泥微生物总RNA的方法，其特征在于，步骤5）所述的TRIzol加入量为0.5～1.5mL/100μL预处理后的污泥。

6.如权利要求1所述的提取厌氧颗粒污泥微生物总RNA的方法，其特征在于，步骤5）、6）和7）所述的离心为9000～11000r/min离心8～12min。

7.如权利要求1所述的提取厌氧颗粒污泥微生物总RNA的方法，其特征在于，步骤6）中，氯仿加入量为150～240μL/100μL预处理后的污泥；

步骤7）中，异丙醇加入量为150～240μL/100μL预处理后的污泥；

步骤8）中10000r/min离心5min。

8.如权利要求1所述的提取厌氧颗粒污泥微生物总RNA的方法，其特征在于，步骤9）中贮存液Ⅲ的加入量为20～40μL/100μL预处理后的污泥。

9.如权利要求1所述的提取厌氧颗粒污泥微生物总RNA的方法，其特征在于，步骤9）中加入DNase I(RNase free)30U和RNase抑制剂40U，并于37℃作用15min。

10.如权利要求1所述的提取厌氧颗粒污泥微生物总RNA的方法，其特征在于，所有耗材都要经过DEPC处理及高压灭菌。