[发明专利]一种高效提取厌氧颗粒污泥微生物总RNA的方法

说明书

技术领域

本发明属于环境分子生物学技术领域，具体涉及一种高效提取厌氧颗粒污泥微生物总RNA的方法。

背景技术

活性颗粒污泥是由以细菌为主的微生物与悬浮物质、胶体物质、腐殖质等混杂在一起所形成的茶褐色絮凝体,其中微生物是废水生物处理过程的主体,它们生理状态的好坏直接影响着处理效果。活性颗粒污泥具有高度的生物多样性且成分极其复杂,不仅含有重金属、腐殖酸等有机污染物,还存在大量核糖核酸酶(RNase)，因此从活性污泥中提取RNA存在一定难度。近年来,随着分子生物学技术的迅速发展,对活性污泥中微生物种群的多样性、功能基因的表达与处理效果之间关系的研究越来越受到环境微生物工作者的重视。

已有研究表明，通过分子生物学手段展开活性污泥中微生物的有关研究主要基于DNA水平进行，但从DNA水平上检测到的微生物多样性、丰度等微生物生态分析不受存活力、代谢状况和环境条件等因素的影响，不能反映真实状态，而在RNA水平上进行的微生物种群分析与基因的表达分析则更能真实地体现分析时的状况，因而提取高质量的RNA是在基因表达水平上研究废水生物处理过程活性污泥中微生物菌群变化及关键调控基因表达规律的必要条件。关于RNA的提取方法，国内外已做过大量的研究报道，主要包括Trizol法、异硫氰酸胍法、酚-SDS法等，但这些方法只能从一般的细菌、动物、植物等材料中提取获得较好质量的RNA，对成分复杂的活性污泥不太适用。目前已报道的环境样品RNA提取方法主要是针对土壤、沉积物等,而活性颗粒污泥与这些环境样品的特性不同，不仅生物量大，而且存在菌胶团，因此这些方法并不太适用成分复杂的活性污泥。尽管国外有文献报道冻融法、珠磨法、试剂盒法等能从土壤、沉积污泥、活性污泥等样品中提取出RNA，但这些方法都有各自的缺点,冻融法很费时,珠磨法需要特殊的仪器珠磨机,试剂盒的价格昂贵,均难以用于大量样品的分析，此外,国内关于活性污泥中RNA的提取方法鲜见报道。另外,不同的提取方法获得的微生物群落基因多样性及其种类、丰度均不同。因而寻找一种操作简便、成本低廉且适合于提取活性颗粒污泥总RNA的方法，全面反映微生物多样性，对于利用分子生物学手段研究活性污泥中的微生物生态、功能基因及表达具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速、有效、高质量的可用于厌氧颗粒污泥的微生物总RNA提取的方法。该方法具有RNA提取总量多、纯度高、降解程度低、完整性好、具有丰富的生物多样性。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种高效提取厌氧颗粒污泥微生物总RNA的方法，包括下列步骤：

1）取活性污泥于灭菌离心管中离心；

2）弃上清，然后向离心管内加入灭菌玻璃珠和贮存液Ⅰ，将离心管管盖拧紧后置于旋涡混合器击打3～8min以解絮凝并洗涤污泥除去腐殖酸，离心；

3）弃上清，重复步骤2）处理1次后，用磷酸盐缓冲液PBS洗涤污泥1次；

4）取步骤3）预处理后的污泥，加入贮存液Ⅱ于30～40℃温育5～15min；

5）加入TRIzol，漩涡振荡3～8min后，离心；

6）取上清，加入氯仿，漩涡振荡10～20s后，室温放置1～4min并离心；

7）取上清，加入异丙醇，－20℃放置15～25min，离心；

8）弃上清，加入75％乙醇洗涤沉淀后，9000～11000r/min离心3～8min；

9）弃上清，风干沉淀，用贮存液Ⅲ溶解核酸沉淀后，加入DNase I(RNase free)25～35U和RNase抑制剂35～40U，并于30～40℃作用10～20min，进一步采用RNA纯化试剂盒纯化RNA。

优选的，步骤1）和2）所述离心为，7000～9000r/min，3～8℃条件下离心3～8min；优选的，步骤1）和2）所述离心为，8000r/min，4℃条件下离心5min。

优选的，步骤2）所述灭菌玻璃珠的直径为2～3mm，灭菌玻璃珠的加入量为0.2～0.4g/ml活性污泥；贮存液Ⅰ的加入量为1～2mL/ml活性污泥；更优选的，灭菌玻璃珠的加入量为0.3g/ml活性污泥；贮存液Ⅰ的加入量为1.4mL/ml活性污泥；优选的，步骤3）中，将离心管管盖拧紧后置于旋涡混合器击打5min以解絮凝并洗涤污泥除去腐殖酸，

步骤3）所述的磷酸盐缓冲液PBS为磷酸盐缓冲液，PH为7.4，组成：NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na2HPO410mmol/L，KH2PO42mmol/L。