[发明专利]白僵菌素的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于工业微生物技术领域，具体涉及到一种白僵菌素制备方法。

背景技术

白僵菌素（beauvericin，BEA）是从真菌球孢白僵菌（Beauverla bassiana）发酵菌丝体中提取分离的一种六元环状缩酯肽化合物，由3个N-甲基苯丙氨酸和3个(D)-α- 羟基异戊酸残基交替相连而成，分子式为C₄₅H₅₇N₃O₉，结构如式（Ⅰ）所示。白僵菌素为白色粉末状，不易溶于水，溶于甲醇、丙酮等有机溶剂，可被检测的紫外吸收光谱范围是204nm-225nm。

白僵菌素是一种具有抗菌、杀虫、抗病毒、抗癌、抑制胆甾醇酰基转移酶活性、引发细胞程序性凋亡等生物活性的脂肽类化合物。目前，白僵菌素主要用作除菌剂和杀虫剂等。在抗菌方面，白僵菌素对一些革兰氏阴性菌（大肠杆菌、根癌土壤杆菌、黄瓜角斑病菌、番茄细菌斑点病菌）和十几种革兰氏阳性菌（枯草芽孢杆菌、双歧杆菌、真杆菌、消化链球菌、溶血葡萄球菌）有一定的抑制作用。在杀虫方面，白僵菌素对蚊子幼虫、卤虫、绿头苍蝇和鞘翅目害虫等有杀伤作用，白僵菌素其同系物具有抗结核和疟原虫的活性等。近年来，越来越多的研究表明白僵菌素除了具有杀虫作用之外还具有很多生物活性。在抗病毒方面，白僵菌素通过抑制HIV-1整合酶产生抗艾滋病毒作用。在抗真菌方面，白僵菌素配合酮康唑使用有显著的抗真菌效果，能够明显减少酮康唑的用量，降低其毒性。在抗癌方面，白僵菌素能够诱导人白血病细胞和人肺癌细胞的凋亡，可引起鼠和人类肿瘤细胞系显著的细胞死亡，并且能够强效和特异地抑制鼠肝脏微体中胆固醇酰基转移酶活性。

作为一个有潜力的抗菌剂和杀虫剂，白僵菌素将越来越多地应用于人类医药和农药中。白僵菌素所具有的解热、降胆固醇、抗惊厥和祛痰等作用，使其在临床上用于治疗流行性腮腺炎和上呼吸道感染等病毒性疾病；作为农药，其还可用于农业或林业防治多种害虫，如防治松毛虫等。另外，白僵菌素还可作为先导化合物发现更多的杀虫剂和药物。因此，白僵菌素众多的药理活性和广阔的应用领域将为其及其衍生物带来良好的市场前景。

关于生产白僵菌素的菌种发酵方法，国内目前报道多为利用球孢白僵菌生产白僵菌素，利用镰刀菌生产白僵菌素的报道较少且多为采用固体发酵获得白僵菌素，固体发酵虽然产量较高，但由于操作繁琐，周期长，且固体发酵易受环境湿度的影响，造成产量水平不稳定，不适合大规模工业化生产。朱颖雪等利用液体静置培养镰刀菌Fusarium sp.F1获得白僵菌素（朱颖雪，钟坤，邵志宇等.镰刀菌Fusarium sp.F1制备白僵菌素的初步研究[J].化学世界，2007，增刊：156-157.），但其耗时长，不利于工业化生产。而液体震荡培养虽偶有报道，但发酵水平不稳定，且原料昂贵，成本极高，规模化生产有很大困难。

关于白僵菌素的分离及纯化方法，Quan-Xin Wang等人将尖孢镰刀菌发酵菌丝体用乙酸乙酯反复提取，蒸干有机溶剂得粗提物，粗提物用水分散后，用二氯甲烷萃取，萃取物经过凝胶柱、硅胶柱、ODS反相柱和反相高效液相制备色谱处理，最终得到白僵菌素（Quan-Xin Wang, Sai-Fei Li, Feng Zhao,et al. Chemical constituents from endophytic fungus Fusarium oxysporum[J]. Fitoterapia, 2011 ,82: 777–781）。Lijian Xu等从盾叶薯蓣镰刀菌属内寄生菌中分离得到白僵菌素，将内寄生菌发酵菌丝体用正丁醇提取后浓缩得粗提物，然后通过硅胶柱、凝胶柱、反相色谱柱纯化制得（Lijian Xu, Jihua Wang, Jianglin Zhao,et al.Beauvericin from the Endophytic Fungus,Fusarium redolens, Isolated from Dioscorea zingiberensis and Its Antibacterial Activity[J]. Natural Product Communications,2010,5:811-814）。专利200810056844采用硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析、RP-18反相柱层析等色谱柱进行反复柱层析，得到白色针状晶体即白僵菌素。以上所提到的三种分离纯化方法均存在同样不足：即操作步骤繁琐，周期长，处理样品少，不适合于工业化生产。

发明内容