[发明专利]用于检测核苷酸结合寡聚化结构域样受体3SNP的试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及检测NLRP3SNP的二重连接探针实时荧光PCR技术。

背景技术

核苷酸结合寡聚化结构域样受体3（NLRP3）主要表达在外周血单核细胞、DC等免疫系统细胞，属于天然免疫系统模式识别受体，参与识别病原微生物分子，启动炎症反应和免疫应答，在内外源性刺激下与接头分子ASC和caspase1组成NLRP3炎性复合体，调节血浆IL-1β、IL-18等炎症因子的成熟分泌，在机体免疫调节、炎症反应、细胞凋亡等过程中发挥重要作用。

疾病关联研究发现NLRP3单核苷酸多态性rs10754558C→G增加超敏反应性疾病发生危险性（J Allergy Clin Immunol2009;124(4):779-785），降低I型糖尿病（Autoimmunity2010;43(8):583-589）和HIV患病风险（Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes2010;54:236-240）；rs1539019C→A降低老年人群外周血浆纤维蛋白原表达水平（Blood2011;117(1):268-275;Circ Cardiovasc Genet2009;2(2):125-133）。

综上，NLRP3SNP对自身免疫性疾病食物或药物过敏、感染性疾病HIV和心血管疾病的发生和预后的风险评估，尤其是一些免疫缺陷、老年人等特殊人群患病的预测具有重要的临床预警意义。开发准确、快速、便捷、高效、经济实惠的检测NLRP3SNP检测试剂盒将为疾病的发生发展起到预测、预防作用。

焦磷酸测序技术是基于酶级联反应的新一代DNA序列分析技术，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶等4种酶的协同作用下，将DNA单链上的每一个dNTP聚合与一次荧光信号释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。该技术具有其独特的优势，无需电泳、DNA片段无需荧光标记。该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、高通量、准确、快捷、灵敏度高等特点，符合大量临床样本检测要求。目前，尚未基于焦磷酸测序技术的NLRP3SNP检测试剂盒的相关报道。

发明内容

有鉴于此，用于检测核苷酸结合寡聚化结构域样受体3SNP的试剂盒，其具有高通量、低成本、高效、准确的特点。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

用于检测核苷酸结合寡聚化结构域样受体3SNP的二重连接探针实时荧光PCR试剂盒，所述二重连接探针实时荧光PCR试剂盒包括:扩增引物组、测序引物，可标记的生物素，所述扩增引物组分别是针对NLRP3rs1539019和/或NLRP3rs10754558位点而设计的特异性序列。

进一步，所述的二重连接探针实时荧光PCR试剂盒中，所述NLRP3rs1539019位点的“C”突变为“A”。

进一步，所述的二重连接探针实时荧光PCR试剂盒中，所述NLRP3rs10754558位点的“C”突变为“G”。

进一步，所述的二重连接探针实时荧光PCR试剂盒，所述扩增引物组有1～2组，包括扩增引物组Ⅰ和/或扩增引物组Ⅱ；

所述扩增引物组Ⅰ的上游引物如SEQ ID NO:1所示，所述扩增引物组Ⅰ的下游引物如SEQ ID NO:2所示；所述测序引物Ⅰ的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述扩增引物组Ⅱ的上游引物如SEQ ID NO:4所示，所述扩增引物组Ⅱ的下游引物如SEQ ID NO:5所示；所述测序引物Ⅱ的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

本发明的目的之二在于提供一种检测核苷酸结合寡聚化结构域样受体3SNP的方法，该方法为二重焦磷酸测序法，分型成功率为100%，接近金标准直接测序法。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

运用所述的二重连接探针实时荧光PCR试剂盒的方法，1）提取严重创伤样本DNA作为模板；2）扩增引物组中的其中之一引物被生物素标记后配制PCR反应体系，并进行PCR扩增，得扩增产物；

3）所述扩增引物经碱变性分开成单链，将被生物素标记的单链进行纯化，用所对应的测序引物进行焦磷酸测序及结果分析。