[发明专利]一种提高植物草铵膦抗性的水稻谷氨酰胺合成酶突变基因及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种提高植物草铵膦抗性的水稻谷氨酰胺合成酶突变基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No3所示。

2.根据权利要求1所述的水稻谷氨酰胺合成酶突变基因，其特征在于，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No4所示。

3.如权利要求1所述的水稻谷氨酰胺合成酶突变基因的表达载体pYM4807-OsGSM1。

4.一种如权利要求1-3任一项所述的水稻谷氨酰胺合成酶突变基因的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)以如SEQ ID No1所示的水稻谷氨酰胺合成酶基因序列为模板，合成如所示SEQ ID No5～SEQ ID No30所示的26条引物，依次命名为引物P1-P26，采用连续延伸PCR法扩增，合成水稻谷氨酰胺合成酶基因，并构建到pBlueScriptII S+载体，得到含有重组的水稻谷氨酰胺合成酶基因的质粒，具体方法如下：

a)分别以引物P1、P10为外侧引物，P2-P9为内侧引物合成片断1；引物P11、P20为外侧引物，P12-P19为内侧引物合成片断2；引物P21、P26为外侧引物，P22-P25为内侧引物合成片断3；

b)各取1μL片段1、片段2、片段3为模板，用外侧引物P1、P26采用连续延伸PCR法扩增得到含有重组的水稻谷氨酰胺合成酶基因；所述反应在50μL反应体系中，内侧引物的添加量分别为10ng，外侧引物添加量分别为100ng；

c)将扩增得到的含有重组的水稻谷氨酰胺合成酶基因克隆到pBluescriptII SK+载体中，获得含有重组的水稻谷氨酰胺合成酶基因的质粒；

2)以前述得到的质粒为模板，以如SEQ ID No31和SEQ ID No32所示的为引物，采用易错PCR法对水稻谷氨酰胺合成酶基因进行随机突变，扩增产物经BamHI和SacI双酶切后，以正确的阅读框插入到大肠杆菌表达载体pYM4807中，通过电击转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得水稻谷氨酰胺合成酶基因的突变文库；

3)将前述得到的突变文库转化到缺陷型菌株JW3841-1，涂布在含有20-100mM草铵膦的培养基上培养，挑取生长正常的单菌落，接种到含氨苄西林的LB液体培养基中培养，初步得到含有草铵膦抗性提高的水稻谷氨酰胺合成酶突变基因的菌样；

4)将初步得到的菌样和含有野生型谷氨酰胺合成酶的菌样稀释到相同浓度，分别滴加到浓度为0，10mM，20mM，100mM草铵膦的培养基上培养，观察在不同浓度草铵磷培养基上的生长情况，抽取得到含有所述突变基因的质粒载体，定义为pYM4807-OsGSM1，该质粒经测序得到所述水稻谷氨酰胺合成酶突变基因。

5.权利要求1所述的水稻谷氨酰胺合成酶突变基因在培育抗草铵膦转基因作物上的应用。