[发明专利]一种提高植物草铵膦抗性的水稻谷氨酰胺合成酶突变基因及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，具体地涉及一种提高植物草铵膦抗性的水稻谷氨酰胺合成酶突变基因及其制备方法和应用。

背景技术

草铵膦(DL-phosphinotricinm)是世界第二大转基因作物耐受除草剂，谷氨酰胺合成酶为草铵膦的靶酶。

草铵膦具有毒性低，在土壤中易于降解，不易飘移，活性高，用量少，环境压力小，杀草迅速等优点。但是，草铵膦是一种非选择性除草剂，在杀灭杂草的同时会影响农作物的生长，限制了草铵膦作为除草剂的使用范围。从Streptomyce hygroscopicus克隆的bar基因和从viridochromogenes中克隆的pat基因均编码草铵膦乙酰转移酶（PPT acetyltransferase，PAT），它通过催化草铵膦氨基的乙酰化可以使草铵膦灭活，应用基因重组技术表达该类基因，是获得耐除草剂转基因农作物的一种方法。

在植物中过量表达谷氨酰胺合成酶，同样可以降低转基因植物对草胺磷的敏感程度（Pascual MB等，Response of transgenic poplar overexpressing cytosolic glutamine synthetase to phosphinothricin。Phytochemistry 200869:382-9）。

但是，草铵膦对来源于植物的野生型谷氨酰胺合成酶的抑制作用非常明显，转化这类基因对提高植物的草铵膦抗性的作用效果不很明显。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高植物草铵膦抗性的水稻谷氨酰胺合成酶突变基因及其制备方法和应用，该突变基因编码的谷氨酰胺合成酶对草铵膦的抗性显著增强，所述的突变基因可用于构建转化植物的表达载体。

为达到上述目的，本发明主要采用如下技术方案：

一种提高植物草铵膦抗性的水稻谷氨酰胺合成酶突变基因，其核苷酸序列如SEQ ID No3所示。其编码的氨基酸序列如SEQ ID No4所示。

采用易错PCR法建立随机突变文库后经筛选获得，突变的核苷酸位点为C216T/T328C/A486G/T584C/A675G/T952C。其中，数字代表突变位点，每个数字前面代表突变前碱基，每个数字后面代表突变后碱基。氨基酸突变点位为His108Tyr/Val200Ala/Arg316Cys。

同时，本发明还提供所述的水稻谷氨酰胺合成酶突变基因的表达载体pYM4807-OsGSM1。

且，本发明还提供一种所述水稻谷氨酰胺合成酶突变基因的制备方法，包括如下步骤：

1)以序列表SEQ ID No1所示的水稻谷氨酰胺合成酶基因序列为模板，合成如序列表所示SEQ ID No5-SEQ ID No30所示的26条引物，依次命名为引物P1-P26，采用连续延伸PCR法扩增，合成水稻谷氨酰胺合成酶基因，并构建到pBlueScriptII S+载体，得到含有重组的水稻谷氨酰胺合成酶基因的质粒，具体方法如下：

a)分别以引物P1、P10为外侧引物，P2-P9为内侧引物合成片断1；引物P11、P20为外侧引物，P12-P19为内侧引物合成片断2；引物P21、P26为外侧引物，P22-P25为内侧引物合成片断3；

b)各取1μL片段1、片段2、片段3为模板，用外侧引物P1、P26采用连续延伸PCR法扩增得到含有重组的水稻谷氨酰胺合成酶基因；所述反应在50μL反应体系中，内侧引物的添加量为10ng，外侧引物添加量为100ng，

具体PCR反应体系如下：

PCR扩增条件为：94℃预热10min；94℃，30s，54℃，30s，72℃，80s，35个循环；最后72℃延伸10min；

c)将扩增得到的含有重组的水稻谷氨酰胺合成酶基因克隆到pBlueScriptII S+载体中，获得含有重组的水稻谷氨酰胺合成酶基因的质粒；

2)以前述得到的质粒为模板，以序列表SEQ ID No31和SEQ ID No32所示为引物，采用易错PCR法对水稻谷氨酰胺合成酶基因进行随机突变，扩增产物经BamHI和SacI双酶切后，以正确的阅读框插入到大肠杆菌表达载体pYM4807中，通过电击转化大肠杆菌DH5α感受态，获得水稻谷氨酰胺合成酶基因的突变文库；

具体PCR反应体系如下：