[发明专利]一种特异性检测Ⅲ型猪嗜淋巴泡疹病毒的引物对、探针和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术，具体涉及一种用于检测Ⅲ型猪嗜淋巴泡疹病毒的PCR引物对、探针和试剂盒。

背景技术

Ⅲ型猪嗜淋巴疱疹病毒（Porcine Lymphotropic herpesviruses 3 ,PLHV3）属于疱疹病毒科γ疱疹病毒属。可以感染猪的一种传染病，通过异体移植猪的细胞、组织和器官可能将这种病毒传染给人。猪嗜淋巴疱疹病有三个亚型，分别为PLHV-1、PLHV-2和PLHV-3。PLHV-1和PLHV-2由EhLers等人于1999年发现，PHLV-3由ChmieLewicz于2003年发现。目前对该病毒的流行病学尚知甚少。作为嗜淋巴病毒成员，在血液的外周血细胞、淋巴结、脾脏和扁桃体等组织经常可检测到PLHV序列片段。猪是人类器官移植的动物代替源中最有发展前景的供体，已有猪源器官成功移植入人体的先例。但猪也是各类病毒的携带者，从猪体内发现过多种可以感染人的病毒，但这些病毒在猪体内并不发病，不容易被人类所认识，只有通过不断的试验和验证，才能确保猪源器官的安全性。已经确认Ⅲ型猪嗜淋巴疱疹病毒可以通过移植猪的细胞、组织和器官传染给人，可能导致接受移植的人体内发生病症。如何对供移植的猪器官和组织在移植前进行猪嗜淋巴疱疹病毒检测，从而从源头确保移植器官和组织的安全性，是一个具有现实的临床医学和经济研究价值的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明公开一种能准确、快速检测Ⅲ型猪嗜淋巴疱疹病毒的引物对。

本发明的另一目的是提供一种与上述引物对配合使用的荧光探针。

本发明的第三个目的是提供检测Ⅲ型猪嗜淋巴疱疹病毒的检测试剂、试剂盒及其反应体系。

本发明的第一个目的通过以下技术方案实现：一种用于检测Ⅲ型猪嗜淋巴泡疹病毒的PCR引物对，其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二个目的通过以下技术方案实现：一种与上述引物对配合使用的荧光探针，其序列为PLHV3 D P1如EQ ID NO.3所示；所述探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团。

所述荧光报告基团为FAM、VIC中的任意一种；所述荧光淬灭基团为TAMRA、Eclipse中的任意一种。

本发明中，所述探针为TaqMan探针。

本发明通过NCBI数据库中获得与Ⅲ型猪嗜淋巴泡疹病毒标准株(GeneBankNo.AY170316) 的所有同源基因序列，并采用MegAlign软件筛选出PLHV3 DNA聚合酶基因（GeneBankNo.AAO12315.1）中一段高度保守序列（如SEQ ID NO.3所示），并以之作为模板，用primer Express3.0 软件，设计出引物及TaqMan 探针。

本发明所述检测PLHV3的引物对并不像常规的基因引物设计一样，只要以PLHV3的基因组序列为基础，采用本领域熟知的引物设计软件设计引物，并通过合乎逻辑的分析、推理和有限的试验，就能够获得特异性强的检测引物。因为PLHV3的基因组序列不太保守，与PLHV1和PLHV2只有66%的氨基酸序列同源性。虽有报道PLHV1与PLHV2间的DNA聚合酶（DPOL）的编码基因较为保守，但二者间仍存在50个碱基对的差异。与上述二者相比，PLHV-3的DPOL编码基因更存在245个碱基对的差异因此，设计能特异性检测PLHV-3的引物是非常困难的，这也是现有技术一直无法解决的困难，本发明通过通过对III型病毒标准株的DPOL基因与Ⅰ型和Ⅱ型的同源基因序列进行对比（Ⅰ型的GeneBankNo.AY177148和AF478169，Ⅱ型的GeneBankNo.AF191043、AY170314和AY170317），筛选出在如SEQ ID NO.4所示的PLHV3中存在的保守序列——PLHV3 DPOL编码基因中一段高度保守的17个碱基对的序列PLHV3 DPOL基因保守片段，进而设计出一对能特异性检测PLHV3的特异性引物。