[发明专利]一种低产尿素的工业黄酒酵母代谢工程菌及其构建方法

权利要求书

1.一种低产尿素的工业黄酒酵母代谢工程菌，其特征在于构建方法为：构建URA3基因敲除组件，分别转化a型和α型单倍体黄酒酵母，得尿嘧啶缺陷型菌株；构建含有PGK1p强启动子和URA3基因的高表达组件，并分别转化所述a型和α型尿嘧啶缺陷型菌株，通过同源重组整合入该菌株基因组，在其DUR1,2基因起始密码前插入PGK1p强启动子，获得DUR1,2基因高表达的原养型单倍体工程菌株，重新融合为二倍体，即得低产尿素的工业黄酒酵母代谢工程菌。

2.根据权利要求1所述低产尿素的工业黄酒酵母代谢工程菌，其具体构建步骤如下：

（1）尿嘧啶缺陷型工程菌的构建

以二倍体工业黄酒酵母DNA为模板，分别扩增URA3基因上游同源臂URA3L和URA3R，再以上述URA3L和URA3R为模板利用融合PCR获得URA3基因敲除组件URA3L-URA3R；将该基因敲除组件分别转化两种配型的单倍体工业黄酒酵母，通过5-FOA平板培养基筛选出尿嘧啶缺陷型菌株Δura3；

（2）DUR1,2基因高表达二倍体工业黄酒酵母工程菌的构建

以二倍体工业黄酒酵母DNA为模板，分别扩增DUR1,2基因起始密码子前300～600bp同源臂片段DUR1,2L、起始密码子后300～600bpp同源臂片段DUR1,2R、完整URA3基因以及PGK1p强启动子；利用降落PCR将上述四个基因片段融合，以融合片段为模板，经特异性扩展获得含有PGK1p强启动子和URA3基因的高表达组件DUR1,2L-URA3-PGK1p-DUR1,2R；将该高表达组件转化步骤（1）所得尿嘧啶缺陷型菌株Δura3，通过同源重组整合入宿主基因组并在其DUR1,2基因起始密码前插入PGK1p强启动子，获得DUR1,2基因高表达的原养型单倍体工程菌株；将所得a型和α型原养型单倍体工程菌株融合，即得低产尿素的工业黄酒酵母代谢工程菌。

3.根据权利要求2所述低产尿素的工业黄酒酵母代谢工程菌，其特征在于：步骤（1）所述URA3L片段的扩增引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；所述URA3R片段的扩增引物序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

4.根据权利要求2所述低产尿素的工业黄酒酵母代谢工程菌，其特征在于：步骤（1）所述URA3L-URA3R片段的扩增引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4所示。

5.根据权利要求2所述低产尿素的工业黄酒酵母代谢工程菌，其特征在于：步骤（2）所述URA3基因片段的扩增引物序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

6.根据权利要求2所述低产尿素的工业黄酒酵母代谢工程菌，其特征在于：步骤（2）所述PGK1p片段的扩增引物序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。

7.根据权利要求2所述低产尿素的工业黄酒酵母代谢工程菌，其特征在于：步骤（2）所述DUR1,2L片段的扩增引物序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示，所述DUR1,2R片段的扩增引物序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。

8.根据权利要求2所述低产尿素的工业黄酒酵母代谢工程菌，其特征在于：步骤（2）所述降落PCR扩增无引物，其扩增条件如下：95℃预变性4min，98℃变性10s，63℃退火15s，每个循环退火温度降低1℃，共15个循环，72℃延伸3min，然后55℃退火再循环一次，最后72℃再延伸10min。

9.根据权利要求2所述低产尿素的工业黄酒酵母代谢工程菌，其特征在于：步骤（2）所述高表达组件DUR1,2L-URA3-PGK1p-DUR1,2R的特异性扩增引物序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:12所示。