[发明专利]一种低产尿素的工业黄酒酵母代谢工程菌及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程和发酵技术领域，具体涉及一种低产尿素和氨基甲酸乙酯（EC）的工业黄酒酵母代谢工程及其构建方法。

背景技术

氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate,简称EC），俗称尿烷，是黄酒发酵过程中伴随产生的有害副产物，具有遗传毒性。随着人们对酒精饮品消费量的增加以及黄酒产业的日益壮大，EC的存在不仅是消费者的健康隐患，更阻碍了黄酒国际化的步伐。因此，控制黄酒中EC的含量显得尤为重要。

尿素是发酵酒中EC的主要前体物质，黄酒中大部分EC来自尿素与乙醇的自发反应产物，而发酵醪液中的尿素的主要来源是由酵母在生长和发酵过程中代谢精氨酸产生。在黄酒发酵过程中，酿酒酵母受到氮代谢阻遏效应（NCR）的影响导致降解尿素的脲基酰胺酶编码基因（DUR1,2）表达水平受到抑制，尿素不能被及时分解，从而被分泌到胞外与发酵醪液中的乙醇发生反应生成EC。

2006年，加拿大van Vuuren研究团队利用代谢工程手段，在葡萄酒工业酵母菌株UC davis522基因组的URA3位点整合入一个组成型高表达脲基酰胺酶基因盒（URA3-PGK1p-DUR1,2-PGK1t-URA3），增强了尿素降解途径，大幅减少了酵母分泌到发酵液中的尿素量，使葡萄酒终产品中EC含量下降了89.1%，其工业化应用亦被批准（Coulon J,etc.(2006)Metabolic Engineering of Saccharomyces cerevisiae to Minimize the Production of Ethyl Carbamate in Wine.American Journal of Enology and Viticulture57(2):113-124）。

2010年，该团队继续以日本清酒常用工业酵母菌株K7和K9为改造对象，利用相同方法构建了低产尿素工程菌株K7EC-和K9EC-，清酒小试发酵显示两株工程菌较出发菌株EC含量分别下降了87%和68%（Dahabieh M.S.,etc.(2010)Functional enhancement of Sake yeast strains to minimize the production of ethyl carbamate in Sake wine.Journal of Applied Microbiology 109(3):963-973）。

Van Vuuren团队改造的葡萄酒和清酒酵母均为二倍体工业酵母菌株，由于缺少可用的缺陷型筛选标记，所以采用了与质粒共转的方式转化酵母，转化效率低，且该高表达组件（URA3-PGK1p-DUR1,2-PGK1t-URA3）用于单倍体菌株改造时，所获得的工程菌为尿嘧啶缺陷型，会影响酿酒酵母的生长和发酵能力。

发明内容

针对现有技术存在的上述缺陷，本申请人经过研究改进，提供一种低产尿素的工业黄酒酵母代谢工程菌及其构建方法。本发明工程菌为原养型，生长和发酵能力与亲本菌株相差无几，可明显降低发酵液中尿素和EC的含量，且具有生物安全性。

本发明的技术方案如下：

一种低产尿素的工业黄酒酵母代谢工程菌，其构建方法为：构建URA3基因敲除组件，分别转化a型和α型单倍体黄酒酵母，得尿嘧啶缺陷型菌株；构建含有PGK1p强启动子和URA3基因的高表达组件，并分别转化所述a型和α型尿嘧啶缺陷型菌株，通过同源重组整合入该菌株基因组，在其DUR1,2基因起始密码前插入PGK1p强启动子，获得DUR1,2基因高表达的原养型单倍体工程菌株，重新融合为二倍体，即得低产尿素的工业黄酒酵母代谢工程菌。

具体地，其构建步骤如下：

（1）尿嘧啶缺陷型工程菌的构建

以二倍体工业黄酒酵母DNA为模板，分别扩增URA3基因上游同源臂URA3L和URA3R，再以上述URA3L和URA3R为模板利用融合PCR获得URA3基因敲除组件URA3L-URA3R；将该基因敲除组件分别转化两种配型的单倍体工业黄酒酵母，通过5-FOA平板培养基筛选出尿嘧啶缺陷型菌株Δura3；

（3）DUR1,2基因高表达二倍体工业黄酒酵母工程菌的构建