[发明专利]一种可调控删除的非病毒游离载体及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种可调控删除的非病毒游离载体及其构建方法。

背景技术

游离的附加体载体（episomal vector）是一类游离于染色体之外并且能够稳定寄生于细胞核内的遗传物质。这种载体主要优点是外源基因可以在细胞内长期表达，不需要载体整合到细胞基因组，避免载体的随机插入引起内源基因发生突变风险。很多年来科学家一直努力开发能够在哺乳动物细胞中自我复制的游离载体（episomal vector）。早期的自我复制的游离载体主要来源于人疱疹病毒（EBV）和SV40病毒载体，它们的缺陷是需要反式作用蛋白的表达，EBV载体需要表达疱疹病毒核抗原1（EBNV-1），SV40载体需要表达大T抗原，这些病毒蛋白长时间表达会引起细胞癌化风险。pEPI-1是目前被广泛研究非病毒自我复制的游离载体，它的核心元件是来自β人干扰素基因5’端的一段DNA序列（chromosomal scaffold/matrixattachment region，S/MAR），S/MAR能够赋予质粒载体在哺乳动物细胞中自我复制和伴随细胞分裂遗传到子代细胞的特性。S/MAR行使其功能需要满足的有两个条件：（1）它必须位于基因的5’端，(2)它必须被转录。与病毒来源的游离附加载体不同的是，pEPI-1载体不需要任何的外源蛋白的辅助，来源人的基因序列安全性很高，非常适用于基因治疗应用。

在很多情况下，我们更希望能够在不再需要基因表达的时候，细胞内的表达载体也能够被永久的去除。尤其是诱导人胚胎样干细胞（iPS）应用于细胞治疗中，研究表明iPS细胞中的外源的诱导因子（Oct4，sox2，cMyc，klf4）的存在，增加iPS在细胞治疗中转化为癌细胞的风险。为了确保iPS细胞治疗的安全，必须将iPS细中的外源因子彻底删除。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种可调控删除的非病毒游离载体及其应用。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种可调控删除的非病毒游离载体，所述游离载体是将Cre/loxP位点特异重组酶系统与S/MAR元件组合形成一种可控的游离载体，所述S/MAR元件来源于的人β干扰素基因。

进一步地，所述游离载体中S/MAR序列上下游各插入一个同向loxp序列。

更进一步地，所述游离载体的核心功能区域从5’端到3’端包括：人的EF1α启动子，loxp序列，来源于人β干扰素基因的S/MAR元件，loxp序列，CAG启动子驱动的新霉素抗性基因和TK基因的表达盒序列。

作为优选，在两个loxp序列之间插入荧光蛋白编码序列，作为指征标记。

其中，所述荧光蛋白编码序列为EGFP编码序列，

本发明还提供了前述游离载体转染的动物细胞。

所述游离载体转染的动物细胞，在不需要载体继续存在时，添加可穿透细胞膜的Cre酶，如TAT-Cre，赋予12-24h，之后加入Ganc药物筛选即可彻底删除载体。

作为优选，所述动物细胞为人iPS细胞（诱导性多能干细胞）。

游离载体转染人iPS细胞的方法为，将前述游离载体插入诱导人iPS细胞的四因子表达盒，转染人体细胞G418筛选诱导人iPS细胞系，获得人iPS细胞。

本发明还提供了前述游离载体在iPS细胞生产以及细胞转分化中的应用。