[发明专利]一种基于红鳍东方鲀FoxO1基因的重组蛋白、制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明具体涉及一种基于红鳍东方鲀FoxO1基因的重组蛋白，以及该重组蛋白的制备方法和应用，属于生物技术领域。

背景技术

脂质是生物体的主要构成成分，与能量的贮存和细胞内信号传导途径等很多生理功能密切相关。鱼类的主要脂质沉积部分是肝脏与肌肉，但在这两种组织中脂质的存在的比例也随着鱼种的不同有着很大的差异，河豚鱼和比目鱼等鱼种的脂质主要贮存在肝脏（瘦鱼），其他的鱼种如真鲷和鳗鱼等鱼类的脂质同时存在于肝脏和肌肉（肥鱼）。组织学研究表明鲑科鱼的肌肉脂质主要被沉积在脂肪细胞即鱼肉的肌膈上。真鲷的脂肪细胞是由前脂脂肪细胞分化而来的，并且过氧化物酶体增殖激活受体（peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs）参与调控，虽然其参与脂肪细胞分化的详细机制不太清楚，很可能是瘦鱼和肥鱼在脂肪细胞的分化过程中有不同的分子调控网络。PPARs家族有三个成员：PPARα、PPARβ、PPARγ，在脂质稳态中发挥重要调控作用。PPARα和PPARβ主要参与脂肪酸氧化代谢，PPARγ主要参与脂肪生成。PPARγ被配体激活调节脂类代谢靶基因的表达，促进脂肪沉积。

在哺乳动物及其细胞系中，叉头转录因子O亚家族1（forkhead transcription factor group O1，FoxO1）是前体脂肪细胞分化过程的重要调控因子，通过多条通路影响细胞增殖、分化、凋亡。FoxO1可以通过阻碍PPARγ功能复合体与DNA的结合从而抑制PPARγ的转录调控活性。在大鼠脂肪组织中研究还发现FoxO1可以抑制PPARγ基因的转录，降低PPARγ的表达量。

迄今，关于FoxO1在哺乳动物脂肪代谢中发挥的调节作用的研究已在人、大鼠、小鼠等哺乳动物中开展并取得了许多成果，但尚未见有关FoxO1蛋白用于调节鱼类体内脂类代谢平衡的相关研究报道。研究和开发与红鳍东方鲀FoxO1蛋白相关的基因克隆及其重组表达具有极其重要的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于红鳍东方鲀FoxO1基因的重组蛋白。

同时，本发明还提供一种基于红鳍东方鲀FoxO1基因的重组蛋白的制备方法。

最后，本发明还提供一种基于红鳍东方鲀FoxO1基因的重组蛋白在制备调节红鳍东方鲀脂肪组织PPARγ表达量的药物组合物或饲料中的应用。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

一种基于红鳍东方鲀FoxO1基因的重组蛋白，其含有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

所述的氨基酸序列由如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列编码。

一种基于红鳍东方鲀FoxO1基因的重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：

（1）反转录PCR（RT-PCR）扩增红鳍东方鲀脂肪组织总RNA，扩增产物与pGEM-T载体连接得重组质粒，经双酶切后目的基因再与pET-32a(+)表达载体连接，获得重组表达质粒；

（2）将重组表达质粒转化入宿主菌，加入诱导剂IPTG诱导表达FoxO1重组蛋白。

所述的反转录PCR扩增的引物对P为：

上游引物P1：5’-CGGAATTCATGGCGGAAGCAGCCCA-3’（见SEQ ID NO:1），

下游引物P2：5’-CCGCTCGAGCCCTGACACCCAGCTGTGC-3’（见SEQ ID NO:2）。

所述步骤（1）中反转录PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min后进行94℃变性40s、61℃复性50s、72℃延伸2min的35个循环的扩增，72℃延伸10min后保存于4℃。

所述步骤（1）中反转录PCR扩增的反应体系为：cDNA模版1.0μl、10μM P11.0μl、10μM P21.0μl、10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo2.5μl、dNTP Mixture(各2.5mM)2.0μl、ddH2O17.0μl、1U/μl KOD-Plus-Neo高保真DNA聚合酶0.5μl，总计25μl。

所述步骤（2）中的宿主菌为大肠杆菌表达菌株Rosetta(DE3)。

所述步骤（2）中取诱导培养后的菌体裂解，离心，取上清液纯化即得重组蛋白。