[发明专利]一种使用固相和液相组合技术制备利西拉来的方法

权利要求书

1.一种利用固相和液相组合技术制备利西拉来的方法，利西拉来的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示， 

所述方法包括以下步骤： 

(1)以氨基树脂为载体，按照Fmoc固相合成方法，将具有侧链保护基团的氨基酸从肽链碳端到氮端依次偶联，获得侧链保护的肽中间体片段a(AA₃₀-AA₄₄)的氨基树脂； 

(2)以三苯甲基树脂为载体，按照Fmoc固相合成方法，将具有侧链保护基团的氨基酸从肽链碳端到氮端依次偶联，获得侧链保护的肽中间体片段b(AA₁₈-AA₂₉)的三苯甲基树脂； 

(3)以三苯甲基树脂为载体，按照Fmoc固相合成方法，将具有侧链保护基团的氨基酸从肽链碳端到氮端依次偶联，获得侧链保护的肽中间体片段c(AA₁-AA₁₇)的三苯甲基树脂； 

(4)将侧链保护的肽中间体片段a、b、c从树脂上切割下来，在溶液中进行缩合反应，得到侧链保护肽(c-b-a)； 

(5)脱除侧链保护肽(c-b-a)的侧链保护基和N端组氨酸上的α-氨基的Boc保护基，得到利西拉来粗肽； 

(6)纯化后得到利西拉来； 

所述具有保护基团的氨基酸中，N端第1位组氨酸的α-氨基的保护基为Boc，其余氨基酸的α-氨基的保护基为Fmoc，赖氨酸与色氨酸的侧链保护基团为Boc，组氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺的侧链保护基团为Trt，天冬氨酸与谷氨酸的侧链保护基团为OtBu，苏氨酸与丝氨酸的侧链保护基团为tBu，精氨酸的侧链保护基团为Pbf。 

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所用的氨基树脂为9-Fmoc-氨基呫吨-3-氧基聚苯乙烯树脂[9-Fmoc-Aminoxanthen-3-yloxy-polystyrene(Sieber Amide树脂)]或9-Fmoc-氨基呫吨-3-氧基乙酰甲基树脂(9-Fmoc-Aminoxanthen-3-yloxy-acetamidomethyl Resin)，优选Sieber Amide树脂。 

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)-(3)中所用的三苯甲基树脂为2-氯-三苯甲基氯树脂(CTC树脂)，氯化三苯甲基树脂，4-甲基氯化三苯甲基树脂或4-甲氧基氯化三苯甲基树脂，优选CTC树脂。 

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)-(3)偶联溶剂为DCM，DMF或NMP中的任意一个或一个以上的组合；偶联体系为HOBt、HOAt、HOOBt或Cl-HOBt中的任意一个或多个与DIC的组合，或为HOBt、HOAt、HOOBt或Cl-HOBt中的任意一个或多个与DPIEA或NMM中的任意一个或两个与HBTU、HATU、PyBOP或PyAOP中的任意一个或多个的组合。 

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)包括： 

(4.1)将片段a从树脂上切割下来，脱除氨基Fmoc保护基；将片段b从树脂上切割下来，二者在溶液中缩合，得到片段(b-a)； 

(4.2)脱除片段(b-a)的氨基Fmoc保护基，与从树脂上切割下来的c片段在溶液中缩合，得到侧链保护肽(c-b-a)。 

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所用的溶剂为NMP或DMF，缩合体系为DCC与HOBt，HOAt或Cl-HOBt中的任意一个或一个以上的组合，或者DIEA与HOBt，HOAt或Cl-HOBt中的任意一个或一个以上的组合与HBTU，HATU，PyBOP或PyAOP中的任意一个或一个以上的组合组成的缩合体系。 

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中把侧链保护的肽中间体片段a、b、c从树脂上切割下来所用的是含有1％-5％三氟乙酸的DCM溶液。 

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中脱除侧链保护肽(c-b-a)的侧链保护基和N端组氨酸上的α-氨基的Boc保护基所用的是三氟乙酸、1，2-乙二硫醇、水和三异丙基硅烷的混合溶液，其体积比为(90-95)∶(2-5)∶(2-5)∶(1-5)。