[发明专利]一种使用固相和液相组合技术制备利西拉来的方法

说明书

技术领域

本发明涉及多肽药物合成技术领域，具体涉及一种固相和液相组合技术制备利西拉来的方法。

背景技术

利西拉来(Lixisenatide，商品名Lyxumia，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)是由Zealand Pharma与Sanofi-Aventis公司合作开发的一种1日给药1次的II型糖尿病治疗药物，其结构是基于具有降糖活性的GLP-1类似物Exendin-4的氨基酸序列，去掉其38位的脯氨酸并在C端加上6个赖氨酸而得到的一种新型GLP-1类似物，能耐受体内二肽基肽酶IV(DPP4)的降解作用。体外研究表明，Lixisenatide与GLP-1受体的亲和力大于内源性GLP-1。II型糖尿病模型实验显示，本品可有效改善血糖水平，且对胰腺β细胞具有潜在保护作用。目前该药物在欧盟的上市申请已获得欧洲药品管理局(EMEA)的批准。

在目前市售的GLP-1受体激动剂类抗糖尿病药物中，只有诺和诺德公司(Novo Nordisk)开发的Victoza(利拉鲁肽)为每天给药1次的产品。据Jefferies分析员预估，到2018年底，每天仅需给药1次的GLP-1受体激动剂的全球销售量将达到25亿美元，Lyxumia极有希望获得6.5亿美元的全球销售额或抢占GLP-1受体激动剂类药物市场份额的15％。

利西拉来可通过基因重组方法来制备，但基因重组方法存在制备技术复杂、成本高昂、非特异结构多、难以纯化等缺点，不适用于工业化生产。中国发明专利CA102558338A公布了一种常规的全固相合成方法来制备利西拉来。全固相合成操作简单，对于一些片段较短的肽链是一个快捷高效的方法。然而，随着肽链的延长，其中疏水性强的肽段形成β-折叠的可能性很大，固相合成方法往往导致出现困难序列。此外，固相肽合成中还存在肽链与树脂载体之间的分子集聚(aggregation)现象，这都会造成偶联和脱保护效率大大降低。很显然，对于含有44个氨基酸的利西拉来来说，这一合成途径需要重复几十步偶联和脱保护步骤，合成路线冗长，操作工艺繁琐；且随着肽链的延长和可能存在的二级结构的影响，缩合效率越来越差，导致杂质变多且难以分离，目标产物收率极低，成本很高，不适合工业化生产。

使用固相和液相结合的片段缩合技术，适合于合成含有较长氨基酸序列的多肽，其优点在于副产物较少且易于纯化，产物纯度高。然而，片段缩合策略有时会受阻于(i)有增加消旋的危险；(ii)大的保护片段溶解度差；(iii)片段间的低缩合率并伴有副反应发生的危险。为了消除或减少消旋，一般选择Gly或Pro作为片段的C端残基，如果不能实现这一点，则选择Ala或Arg作为C端残基，因为它们不易消旋。在应用片段缩合策略时，对目标序列进行合理的分段可以大大改善结果。除了合理选择C端残基，尽量减少消旋的风险，还应考虑在固相上合成的片段的纯度要高，溶解性要好；参与缩合的片段的C端和N端残基的空间位阻要小，以提高片段间的缩合率。

鉴于利西拉来重要的药学应用价值，有必要提供更有效的利西拉来合成方案，能够克服以上方法的缺陷并适合工业规模的生产。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种新的利西拉来的制备方法，该方法能够克服现有制备方法的不足与缺陷，并适合工业化生产。

本发明中利西拉来的制备方法，采用的是固相合成片段和片段液相缩合的组合技术。首先利用固相化学在树脂载体上合成利西拉来的3个侧链保护的中间体片段肽：片段a(1-17)，片段b(18-29)，片段c(30-44)，然后在液相中将侧链保护的中间体片段肽缩合，最后脱除氨基端及侧链保护基得到利西拉来。本方法中选择了适宜的3个片段肽，通过常规固相合成法均可以高效率、高产率、高纯度的获得各个片段肽；各个片段肽在液相缩合体系中溶解度高，且参与缩合的片段的C端和N端空间位阻小，缩合产率高，产物易于纯化。

具体而言，本发明提供的利西拉来制备方法，包括以下步骤：