[发明专利]K-ras基因8种突变荧光分型检测试剂盒及检测方法在审
| 申请号： | 201310732595.5 | 申请日： | 2013-12-25 |
| 公开（公告）号： | CN103695555A | 公开（公告）日： | 2014-04-02 |
| 发明（设计）人： | 吴舒歌;吴大治;夏懿 | 申请（专利权）人： | 上海星耀医学科技发展有限公司;上海复星医药（集团）股份有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/68 | 分类号： | C12Q1/68 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 201315 上海*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | ras 基因 突变 荧光 检测 试剂盒 方法 | ||
1.一种人类K-ras基因8种突变荧光分型检测试剂盒，该试剂盒包括PCR混合反应液、等位基因特异性MGB探针、通用上游引物、ARMS下游引物、野生型内标探针及野生型下游引物，以及阳性对照品。
2.根据权利要求1所述的人类K-ras基因8种突变荧光分型检测试剂盒，其特征在于：所述PCR混合反应液中含PCR Buffer、UNG酶、Taq DNA聚合酶、MgCl2、dNTPs。
3.根据权利要求1所述的人类K-ras基因8种突变荧光分型检测试剂盒，其特征在于：所述等位基因特异性MGB探针序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示。
4.根据权利要求1所述的人类K-ras基因8种突变荧光分型检测试剂盒，其特征在于：所述通用上游引物序列如SEQ ID NO:9所示； 所述ARMS下游引物序列如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17所示。
5.根据权利要求1所述的人类K-ras基因8种突变荧光分型检测试剂盒，其特征在于：所述野生型内标探针序列如SEQ ID NO:18所示；所述野生型下游引物序列如SEQ ID NO:19所示。
6.根据权利要求1所述的人类K-ras基因8种突变荧光分型检测试剂盒，其特征在于：所述等位基因特异性MGB探针包括如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的序列中的一种或多种时，所述阳性对照品是存在密码子12 GGT > GAT和12 GGT > AGT置换突变的混合质粒DNA。
7.根据权利要求1所述的人类K-ras基因8种突变荧光分型检测试剂盒，其特征在于：所述等位基因特异性MGB探针包括如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的序列中的一种或多种时，所述阳性对照品是存在密码子12 GGT > GTT和12 GGT > GCT置换突变的混合质粒DNA。
8.根据权利要求1所述的人类K-ras基因8种突变荧光分型检测试剂盒，其特征在于：所述等位基因特异性MGB探针包括如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的序列中的一种或多种时，所述阳性对照品是存在密码子12 GGT > TGT和12 GGT > CGT置换突变的混合质粒DNA。
9.根据权利要求1所述的人类K-ras基因8种突变荧光分型检测试剂盒，其特征在于：所述等位基因特异性MGB探针包括如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的序列中的一种或多种时，所述阳性对照品是存在密码子13 GGC > GAC和13 GGC > CGC置换突变的混合质粒DNA。
10.一种人类K-ras基因8种突变荧光分型检测方法，其特征在于：包括以下步骤：按常规方法提取待检测样本的基因组DNA，然后分4个反应管（A、B、C、D）进行检测，首先在每个反应管中分别加入PCR混合反应液、通用上游引物、野生型内标探针及野生型下游引物，然后在反应管A加入检测密码子12 GGT > GAT与12 GGT > AGT置换突变的MGB探针和ARMS下游引物；在反应管B加入检测密码子12 GGT > GTT与12 GGT > GCT置换突变的MGB探针和ARMS下游引物；在反应管C加入检测密码子12 GGT > TGT与12 GGT > CGT置换突变的MGB探针和ARMS下游引物；在反应管D加入检测密码子13 GGC > GAC与13 GGC > CGC置换突变的MGB探针和ARMS下游引物，进行核酸样本的荧光定量PCR检测；
所述通用上游引物的序列如SEQ ID NO:9所示；
所述野生型内标探针及野生型下游引物序列如SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19所示；
所述用于检测密码子12 GGT > GAT与12 GGT > AGT置换突变的MGB探针和ARMS下游引物序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11所示；
所述用于检测密码子12 GGT > GTT与12 GGT > GCT置换突变的MGB探针和ARMS下游引物序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13所示；
所述用于检测密码子12 GGT > TGT与12 GGT > CGT置换突变的MGB探针和ARMS下游引物序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15所示；
所述用于检测密码子13 GGC > GAC与13 GGC > CGC置换突变的MGB探针和ARMS下游引物序列如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17所示。
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