[发明专利]K-ras基因8种突变荧光分型检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术及临床分子诊断领域，尤其涉及一种人类K-ras基因8种突变检测试剂盒及检测方法。

背景技术

K-ras基因是RAS基因家族中的一种，定位在人类的12号染色体上，是一种原癌基因，对人类癌症影响很大。K-ras基因编码分子量为21kD的ras蛋白又名p21蛋白，p21蛋白位于细胞膜的内表面，具有GTP酶活性，参与细胞内的信号传导，结合GTP时为活化态，结合GDP时为失活态。K-ras基因在机体内好像分子开关，它在肿瘤细胞生长以及血管生成等过程的信号传导通路中起着重要调控作用，正常的K-ras基因可抑制肿瘤细胞生长，但发生异常时会诱导基因永久活化，使细胞内信号传导紊乱，细胞增殖失控而癌变。K-ras基因被激活的方式有3种：基因点突变、基因大量表达、基因插入及转位。其中点突变最常见，多发生在2号外显子的12号密码子和13号密码子上，密码子61、63、117、119和146较少见。

K-ras基因是目前确认的肿瘤靶向治疗药物的重要基因标记物之一，K-ras基因突变是预测EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TK1）和表皮生长因子受体（EGFR）单克隆抗体（帕尼单抗和西妥昔单抗）靶向治疗抵抗的重要因素之一。在EGFR信号通路中，K-ras及其下游区小分子G蛋白是该信号通路的基本组成部分之一。K-ras基因突变后可以使该通路异常活化，不受EGFR上游信号指令的影响。此时，EGFR单抗与细胞膜表面EGFR结合，虽阻滞了信号通路的下传，但K-ras基因突变后可发生自身磷酸化，抗拒EGFR单抗的作用，从而对EGFR单抗药物治疗无效。因此，运用EGFR靶向药物治疗之前必须要进行K-ras基因突变检测，根据患者的基因突变状态选择合适的药物，提高治疗的针对性，最大程度的延长患者的生存期。

目前，有关K-ras基因突变的检测在结直肠癌和肺癌治疗中已经得到临床认可和使用。 最早2008年6月在美国临床肿瘤学会(ASCO)年会上发布了临床研究结果，即K-ras突变型患者并不能从抗EGFR治疗中获益，反而徒增不良反应危险和治疗费用；而K-ras野生型患者就很有可能从这类药物治疗中获益。同年10月，K-ras基因突变检测被写入最新版(2008年第3版)《美国国立癌症综合网络(NCCN)结直肠癌临床实践指南》。该指南明确指出所有转移性结直肠癌患者都应检测K-ras基因状态， 并且只有K-ras野生型患者才建议接受EGFR抑制剂（如西妥昔单抗和帕尼单抗）治疗。另外，《09年NCCN非小细胞肺癌临床实践指南》明确指出：当K-ras基因如果发生了突变，则不建议病人使用特罗凯（厄洛替尼）进行分子靶向治疗，K-ras基因突变与非小细胞肺癌（NSCLC）对吉非替尼、厄罗替尼等靶向治疗药物的原发性耐药有关。 因此肿瘤患者接受EGFR靶向药物治疗之前，必须进行K-ras基因突变检测，根据检测结果决定是否使用EGFR靶向药物作为临床治疗措施，以提高肿瘤临床治疗的针对性，降低治疗费用，节省宝贵的治疗时间。

    目前常用的K-ras点突变检测的方法有DNA直接测序法、单链构象多态性分析法（PCR-SSCP）、限制性片段长度多态性分析法（PCR-PFLP）、高分辨溶解曲线（HRM）、基因芯片、液相芯片法、荧光定量PCR法等。测序法是公认的基因突变检测的金标准，能够准确地显示可能存在的具体突变类型，但测序法所用的设备成本高、检测时间稍长、操作繁琐、灵敏度较低，而且结果判读较复杂，对操作者要求较高，难以形成商业化的诊断产品。单链构象多态性分析与限制性片段长度多态性分析步骤繁多、灵敏度低，而且检测结果经常需要测序法确认，也不是适用于临床检测的简便有效的方法。高分辨溶解曲线是近年来兴起的一种检测基因突变、进行基因分型和SNP检测的新工具，可以迅速的检测出核酸片段中单碱基的突变。但是该方法难于筛查纯合突变，并且假阳性假阴性较高，PCR条件苛刻，不能分型，而且检测结果需要测序法确认。基因芯片和液相芯片虽能准确区分具体的突变类型，但是其对设备要求高，难以大规模推广，多用于科研单位。