[发明专利]人血管炎诊断试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种人血管炎诊断试剂盒及其制备方法，属于医学实验诊断技术领域。

背景技术

系统性血管炎（systemic vasculitis)是一组以血管坏死和炎症为主要病理改变的疾病，临床表现因受累血管的类型、大小、部位及病理特点不同而表现各异。常见的血管炎有魏格纳氏肉芽肿、显微镜下血管炎、肺出血-肾炎综合征和结节性多动脉炎等。其常累及全身多个系统，既可以引起多系统多脏器功能障碍，但也可局限于某一脏器。临床上主要表现为不明原因的腹泻，以及发烧，腹痛，直肠出血等。随着病情的发展，有些病人还出现不同程度的肠道外症状，如肝脏方面的疾患，关节炎，皮肤和眼睛方面的症状。由于其临床表现复杂，病情偏重，早期诊治困难，致残率、病死率高，预后差，因此，该疾病的早期诊断、治疗非常重要。

特征性的抗中性粒细胞胞质抗体（anti-neutrophil cytoplasmic antibody,ANCA)是一种以中性粒细胞和单核细胞胞质成分为靶抗原的自身抗体，包括了大量的自身抗体，其中抗蛋白酶3(PR3)抗体和抗髓过氧化物酶(MPO)抗体具有明确的临床诊断意义，是最重要的ANCA抗体。研究已经证实抗PR3和抗MPO抗体参与了血管炎的发病机制，两种抗体可以激活人中性粒细胞并致脱颗粒反应，使中性粒细胞释放大量有害的蛋白水解酶和氧自由基，从而导致小血管壁的损害，造成血管炎的发生。

目前临床检测系统性血管炎时，采用ELISA法测定抗PR3抗体和抗MPO抗体，并采用间接免疫荧光法（IIF法）检测ANCA。IIF法测ANCA时多采用乙醇固定中性粒细胞的抗原片进行，容易受到样本中抗核抗体（ANA）的影响，ANA会在乙醇固定片上出现难与ANCA区别的荧光颗粒，当患者的ANA呈强阳性时尤其明显，会产生干扰实验结果的判断。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种人血管炎诊断试剂盒，该试剂盒能够排除ANA干扰，并且实现抗PR3抗体和抗MPO抗体的定量检测。

本发明要解决的第二个技术问题是提供上述试剂盒的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

人血管炎诊断试剂盒，组成包括：

（1）待检测血清标识物的标准品；

（2）包被有识别标识物特异抗原系统的固相板；

（3）联接有辣根过氧化酶的标识物的抗体；

（4）洗涤液；

（5）辣根过氧化酶底物的溶液；

（6）终止液。

所述（1）待检测血清标识物的标准品为抗人PR3和MPO抗原免疫球蛋白G。

所述（2）包被有识别标识物特异抗原系统的固相板包括：包被人粒细胞的固相板、包被抗人PR3抗原免疫球蛋白G的固相板和包被抗人MPO抗原免疫球蛋白G的固相板；

所述（3）联接有辣根过氧化酶的标识物的抗体为抗非人类免疫球蛋白G抗体。

所述（4）洗涤液为磷酸盐缓冲液。

所述的（5）辣根过氧化酶底物的溶液包含A液和B液，其中A液为过氧化氢溶液，B液为四甲基联苯胺溶液，或者A液为四甲基联苯胺，B液为醋酸钠/枸橼酸缓冲液。

所述（6）终止液为2M硫酸。

所述（1）待检测血清标识物的标准品的制备方法为：由高效价抗人PR3和MPO的血清中制备免疫球蛋白G抗血清，提纯IgG，经QAE化学试剂处理血清并分离血清，将高效价的抗PR3和MPO的免疫球蛋白G血清混合制备，灭活补体，再加稳定剂处理，对所获样品用电泳法做纯度检测，计算纯度。

所述的包被人粒细胞的固相板的制备方法为：包括进行粒细胞提取，计算细胞纯度和活性检测，细胞包被步骤，其细胞包被的方法为用1╳Hank平衡盐溶液(HBSS)稀释粒细胞，使其至终浓度约为100-1000000cells/mL，然后将悬液加入到96孔细胞培养板中，每孔100μL，静置于室温，去上清，室温干燥，后用冷甲醇固定并干燥，用封盖膜将固定细胞的微孔板封盖，放置20℃保存备用；所述包被抗人PR3抗原免疫球蛋白G的固相板和包被抗人MPO抗原免疫球蛋白G的固相板的制备方法是：以0.05M磷酸盐缓冲液作为包被缓冲液，包被抗原的浓度为0.04-1.0微克/ml，包被溶液在微孔板的孔中4℃，24小时，用去离子水洗涤两次，2%牛血清白蛋白室温封闭1.5小时后，在温度为20-28℃及湿度小于或等于30%的条件下干燥12小时，然后装袋封口，储存于4℃待用。

一种人血管炎诊断试剂盒的制备方法，试剂盒包括：

（1）待检测血清标识物的标准品；