[发明专利]一种基于LAMP技术的番茄细菌性溃疡病的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种基于LAMP技术快速鉴定番茄细菌性溃疡病菌的检测方法。

背景技术

番茄溃疡病是番茄生产中最为严重、具有毁灭性的病害之一。其病原菌为密执安棒杆菌密执安亚种，即Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis，简称Cmm。

该病自从1909年首次在美国密执安州的温室番茄上发现以来，现己广泛分布于美国各番茄产区，并逐渐成为世界性病害。20世纪年代、60年代和80年代，番茄溃疡病在美国中西部地区、北卡罗来那州及加拿大安大略地区大流行，造成的产量损失最高达以上。一年期间，该病在英国大流行，使番茄罐头工业受到严重影响。目前， 在美洲、欧洲、亚洲、非洲和大洋洲的多个国家都有番茄溃疡病发生危害的报道。我国有关番茄溃疡病的记载始于1981年，目前番茄溃疡病在我国北京、黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、新疆、河北、山西、山东、上海、海南等省、市、自治区都有发生， 使许多地区番茄生产受到了不同程度的影响。因此， 我国1995年将该病原菌列入《全国植物检疫对象名单》， 2007年列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。

目前国内通用的GB、SN等标准采用培养、生化反应等表型检测方法和PCR、基因芯片和测序比对等分子检测方法辅助相结合的方法，检验周期需要2-7天，且操作复杂，成本较高，难以适应当代贸易中快速检验的客观需求。尤其是在田间地头和码头海港等野外工作条件下，不具备PCR往往无法开展快速检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于LAMP技术快速鉴定番茄细菌性溃疡病菌的检测方法，以满足对出入境检验检疫中番茄细菌性溃疡病的鉴定。

实现本发明的技术方案为：

    一种基于LAMP技术快速鉴定番茄细菌性溃疡病菌的检测方法，所述检测方法包括LAMP 引物的设计与合成、模板DNA的提取、LAMP 扩增体系建立，LAMP 扩增方法，所述的LAMP 扩增方法反应温度为63℃左右、反应在90min 内完成扩增，引物包括外引物、内引物；

所述的外引物是Cmm-F3 和Cmm-B3 ；

所述的内引物是Cmm-FIP 和Cmm-BIP；

所述引物序列自5' 端到3' 端如下：

Cmm-F3   CGCTCATGGGTGGAACAT

Cmm-B3    CGGAAAGGGTCCGACAAG

Cmm-FIP     ACGTTCCCACCCCACAAGGATTTTGACATTGATGCCGGCTGA

Cmm-BIP     CTGGTGTGTCGAGGGCATGTTTTTAAACCAGACACACCCAGAAG。

    其中，所述模板DNA提取指番茄组织DNA的提取，离心提取其上清液，具体步骤为：

称取80mg样品，加入到2ml的离心管中；加入600μL裂解液充分混匀。65℃温浴至少30分钟。然后加入300μL蛋白沉淀液，13000rpm离心4min。将上清液转移至另一干净的1.5ml离心管中；若上清很混浊可以再加等体积的氯仿/异戊醇（24：1）颠倒混匀，13000rpm离心4min,将上清液转移至另一干净的离心管中；加入0.8倍体积异丙醇，-20℃沉淀30min。13000rpm离心4min，弃上清，加入600μL 70%乙醇，13000rpm离心4min，弃上清，晾干，加TE溶液30μL溶解。

    所述LAMP 扩增体系建立是采用水溶液配置，体系总体积25μL，其中包括：

模板DNA   2μL

2×U-LAMP MIX  17μL

Cmm-F3 5uM， 1μL

Cmm-B3 5uM， 1μL 

Cmm-FIP    40uM， 1μL

Cmm-BIP    40uM， 1μL

Bst DNA 酶    8 U/μL， 1μL

荧光染料  1μL。

    所述LAMP扩增方法采用实时荧光PCR仪，将按照LAMP扩增体系配制好的试剂加入反应器中，63℃左右反应1小时，共分为40个循环，每个循环1分钟30秒，每个循环结束时收集荧光。

所述LAMP扩增方法采用普通水浴锅或金属浴完成，将按照LAMP扩增体系配制好的试剂加入PE管中，放入63℃左右水浴锅中保温90min，然后取出放入另一80℃水浴锅中保温10 min后，取出。