[发明专利]一种人体表皮组织的快速构建制备方法

权利要求书

1.一种人体表皮组织的快速构建制备方法，其特征在于：使用的化学物质材料为：人体皮肤组织、壳聚糖、明胶、人体表皮角质形成细胞培养液、高糖培养基、氯化钙、碘酒、磷酸盐溶液、硫酸庆大霉素、青霉素、蛋白酶、胶原酶、胎牛血清、胰蛋白酶、乙二胺四乙酸、醋酸、戊二醛、氢氧化钠、硼氢化钠、二氧化碳、灭菌去离子水、二甲基亚砜、生理盐水，其准备用量如下：以克、毫升、毫米、厘米³为计量单位；

人体皮肤组织：                                    50g±0.1g

壳聚糖：                                          5g±0.01g

明胶：                                            5g±0.01g

人体表皮角质形成细胞培养液：Ca²⁺浓度0.09 mmol/L    200mL±1mL

高糖培养基：Ca²⁺浓度1.8mmol/L                     200mL±1mL

氯化钙：                                          0.5 g±0.001g

碘酒：                                            10mL±0.1mL

磷酸盐溶液：                                      500mL±5mL

硫酸庆大霉素：40000单位/mL                       4mL±0.1mL

青霉素：800000单位/g                              5g±0.1g

蛋白酶：                                          0.5g±0. 001g

胶原酶：                                          0.5g±0. 001g

胎牛血清：                                        20mL±1mL

胰蛋白酶：                                        0.5g±0. 001g

乙二胺四乙酸：                                    0.05g±0. 001g

醋酸：                                            5mL±0.1mL

戊二醛：浓度50%                                  5mL±0.1mL

氢氧化钠：                                       5g±0.1g

硼氢化钠：                                       5g±0.1g

二氧化碳：气体                                   5000cm³±100cm³

灭菌去离子水：                                   1000mL±10mL

二甲基亚砜                                       2mL±0.1mL

生理盐水                                         100mL±1mL

快速构建制备方法如下：

配制细胞培养液

配制人体真皮成纤维细胞培养液：

量取高糖培养基90mL，胎牛血清10mL，混匀，成人体真皮成纤维细胞培养液；

配制人体表皮角质形成细胞与人体真皮成纤维细胞培养液的混合培养液：

量取人体表皮角质形成细胞培养液100mL、高糖培养基100mL，比例1:1，混匀，加入氯化钙0.0105g，震荡摇晃5min，过滤器过滤，在冰箱保存，保存温度4℃，成混合培养液；

人体表皮角质形成细胞与人体真皮成纤维细胞的提取

手术获取人体皮肤组织

选取健康人体，手术提取人体皮肤组织50g；

将人体皮肤组织置于培养皿中，加入碘酒10mL，迅速进行冲洗；

量取磷酸盐溶液500mL，加入硫酸庆大霉素2mL、青霉素0.125g，过滤器过滤，成混合液；将冲洗后的人体皮肤组织置于另一培养皿中，加入磷酸盐溶液-硫酸庆大霉素-青霉素混合液10mL，浸泡人体皮肤组织，浸泡时间15min；

用剪刀、刀片刮除人体皮肤组织真皮皮下组织，用磷酸盐溶液-硫酸庆大霉素-青霉素混合液10mL，浸泡5min；

量取人体表皮角质形成细胞培养液10mL，加入蛋白酶0.025g，摇匀，过滤器过滤，将人体皮肤组织表皮面朝上平铺于无菌培养皿中，加入人体表皮角质形成细胞培养液-蛋白酶混合溶液10mL，在冰箱4℃下无菌放置12h；然后用尖镊分离人体皮肤组织，使表皮与真皮分开；

量取高糖培养基10mL，加入胶原酶0.02g，摇匀，过滤器过滤，将人体皮肤组织的真皮组织剪碎，成1mm³块，加入高糖培养基-胶原酶溶液10mL，置于恒温培养箱中，在37℃下消化240min，然后加入胎牛血清1mL，混匀，成混合溶液；

离心分离人体真皮成纤维细胞，静置培养

将混合溶液收集于离心管内，进行离心分离，分离转数1200r/min，时间5min，倒掉上清液，加入人体真皮成纤维细胞培养液5mL，吹匀细胞，成细胞悬液；将细胞悬液收集于培养瓶中，将盛有细胞悬液的培养瓶置于恒温培养箱中，在37℃、5 %二氧化碳气体下静置培养，培养时间72h后，倒掉人体真皮成纤维细胞培养液，再次加入人体真皮成纤维细胞培养液5mL，继续培养时间72h；

量取磷酸盐溶液100mL，加入胰蛋白酶0.25g、乙二胺四乙酸0.01g，摇匀，过滤器过滤，将人体皮肤组织的表皮组织剪碎，成1mm³块，加入磷酸盐溶液-胰蛋白酶-乙二胺四乙酸混合液10mL，置于恒温培养箱中，在37℃下消化5min；

离心分离人体表皮角质形成细胞，静置培养

用200目不锈钢筛网过滤表皮碎片，与混合液混合，收集于离心管内，进行离心分离，分离转数1200r/min，时间5min，倒掉上清液，加入人体表皮角质形成细胞培养液5mL，吹匀细胞，成细胞悬液；将细胞悬液收集于培养瓶中，将盛有细胞悬液的培养瓶置于恒温培养箱中，在37℃、5 %二氧化碳气体下静置培养72h后，倒掉人体表皮角质形成细胞培养液，再次加入人体表皮角质形成细胞培养液5mL，持续培养时间72h；

制备壳聚糖-明胶膜片

配制醋酸水溶液

量取醋酸1mL，灭菌去离子水99mL，放入烧杯中，混匀，成醋酸水溶液；

溶解壳聚糖

称取壳聚糖4g，加入醋酸水溶液96mL，搅拌4h，使其溶解，成壳聚糖醋酸水溶液；

配制明胶水溶液

称取明胶4g，量取灭菌去离子水96mL，置于烧杯中，然后置于水浴箱中，加热温度40℃，使其溶解，成溶解液；

将溶解液用100目滤纸过滤，得明胶水溶液；

配制壳聚糖-明胶溶液

量取壳聚糖醋酸水溶液95mL，明胶水溶液95mL，比例1:1，加入烧杯中，磁力搅拌60min，

然后置于水浴箱中，在40℃恒温混匀12h，成壳聚糖-明胶溶液；

配制戊二醛水溶液

量取戊二醛0.08mL，量取灭菌去离子水15.92mL，混匀，成0.05mol/L的戊二醛水溶液；

壳聚糖-明胶溶液中添加戊二醛水溶液

将戊二醛水溶液16mL、壳聚糖-明胶溶液185mL，加入烧杯中，快速搅拌15min，成壳聚糖-明胶-戊二醛混合溶液；

制备水凝胶

将壳聚糖-明胶-戊二醛混合溶液倒入96孔培养板中，孔径为6mm，在25℃下静置12h，成水凝胶；

冷冻、冷冻干燥

将水凝胶置于冷冻箱中冷冻，在-20℃冷冻24h，然后在-80℃冷冻24h；

将冷冻的水凝胶置于石英容器中，然后置于冷冻干燥箱中干燥，冷冻干燥温度-80℃，真空度18Pa，时间24h，形成?5mm×1mm的圆柱体薄膜；

清洗、还原戊二醛

配制0.25mol/L的氢氧化钠水溶液100mL；

配制0.26mol/L的硼氢化钠水溶液100mL；

加入灭菌去离子水100mL，加入烧杯中，成中性混合液；

将冷冻干燥的壳聚糖-明胶薄膜置于中性混合液中浸泡60min，然后将薄膜置于另一烧杯中，加入灭菌去离子水200mL冲洗薄膜，使薄膜的pH=7，呈中性；

冲洗后薄膜置于冷冻箱中冷冻，在-20℃冷冻24h，然后在-80℃冷冻24h；将冷冻的薄膜置于石英容器中，然后在冷冻干燥箱中干燥，冷冻干燥温度-80℃，真空度18Pa，时间24h；

γ射线辐射灭菌

将壳聚糖-明胶薄膜装入密封玻璃瓶中，用γ射线辐射灭菌，γ射线辐射剂量25kgy，灭菌时间24h，灭菌后薄膜为无菌保存；

（4）人体表皮组织的快速构建和制备

人体表皮组织的快速构建和制备是在高压釜内，在气体压力中进行的，是在37℃下、3.4KPa压力下、无菌状态下完成的；

将壳聚糖-明胶薄膜置于培养皿中，加入人体表皮角质形成细胞培养液10mL、人体真皮成纤维细胞培养液10mL，置于恒温培养箱中，加热温度37℃，恒温培养12h；

将湿润的壳聚糖-明胶薄膜置于无菌洁净工作台上吹干；

接种细胞

倒掉培养瓶中的人体表皮角质形成细胞培养液，在培养瓶中加入磷酸盐溶液-胰蛋白酶-乙二胺四乙酸混合液5mL，置于恒温培养箱中，在37℃消化5min，成细胞悬液，然后收集于离心管中，进行离心分离，分离转数1200r/min，时间5min，倒掉上清液，加入人体表皮角质形成细胞培养液5mL，吹匀细胞，成细胞悬液；将人体表皮角质形成细胞以30万个/cm²的密度接种于壳聚糖-明胶薄膜上，用人体表皮角质形成细胞培养液浸没培养24h；

倒掉培养瓶中的人体真皮成纤维细胞培养液，在培养瓶中加入磷酸盐溶液-胰蛋白酶-乙二胺四乙酸混合液5mL，置于恒温培养箱中，在37℃消化5min，成细胞悬液，然后收集在离心管中，进行离心分离，分离转数1200r/min，时间5min，倒掉上清液，加入人体真皮成纤维细胞培养液5mL，吹匀细胞，成细胞悬液；将人体真皮成纤维细胞以30万个/cm²的密度接种于壳聚糖-明胶薄膜上，用人体真皮成纤维细胞培养液浸没培养24h，

生成：人体表皮角质形成细胞-壳聚糖-明胶复合组织块、人体真皮成纤维细胞-壳聚糖-明胶复合组织块；

将人体真皮成纤维细胞-壳聚糖-明胶复合组织块置于96孔培养板中底层，作为滋养层，将人体表皮角质形成细胞-壳聚糖-明胶复合组织块置于96孔培养板上层，每孔中加入人体表皮角质形成细胞与人体真皮成纤维细胞的混和培养液0.1mL，并施加无菌空气与二氧化碳混合气体，高压釜内底层置放灭菌去离子水，做湿润剂，加热温度37℃，气体压力3.4KPa，气体压力3.4KPa，进行气-液界面压力培养72h；

气-液界面压力培养后，在96孔培养板上合成人体表皮组织；

（5）人体表皮组织的检测、分析、表征

对制备的人体表皮组织的形貌、细胞生长、分层进行检测、分析、表征；

用酶联免疫检测仪进行人体表皮组织中人体表皮角质形成细胞的增殖情况；

用倒置显微镜进行人体表皮角质形成细胞排列及分层的检测；

结论：制备的人体表皮组织为无色薄膜状，组织成分为人体表皮角质形成细胞-壳聚糖-明胶复合物，组织活性良好，人体表皮角质形成细胞分层生长良好；

（6）人体表皮组织的保存

人体表皮角质形成细胞培养液8mL，加入胎牛血清1mL，二甲基亚砜1mL，形成人工表皮保护液；人体表皮组织置于棕色透明无菌的塑料容器中，加入保护液10mL，在4℃放置30min；在-20℃放置30min；在-80℃放置24h；在液氮中长期保存；

（7）人体表皮组织的复温

将盛有保护液和人体表皮组织的塑料容器置于恒温水浴箱中，在37℃下解冻5min，人体表皮组织复温，用无菌生理盐水冲洗人体表皮组织3次，每次1min。

2.根据权利的要求1所述的一种人体表皮组织的快速构建制备方法，其特征在于：人体表皮组织的快速构建制备是在高压釜内、在气体压力中进行的，是在37℃下、在3.4KPa压力下、无菌状态下完成的；

高压釜为矩形，高压釜（1）下部为电控箱（18）、上部为高压密封釜盖（2）；在高压釜（1）内底部为灭菌去离子水（6），高压釜（1）内中间位置安装支架（3），在支架（3）上置放培养板（4），在培养板（4）上置放人体表皮组织（5），在人体表皮组织（5）上部由混合气体（7）充填；在高压密封釜盖（2）上部由左至右设置进气管（10）、气压表（9）、出气阀（8），进气管（10）左部连接混合气体过滤灭菌装置（11）、混合气体进气阀（12），混合气体进气阀（12）通过进气管（10）同时连通二氧化碳气体阀（13）、压缩空气气体阀（14），二氧化碳气体阀（13）连通二氧化碳气体瓶（16），压缩空气气体阀（14）连通空气压缩机（15）；在高压釜（1）的下部为电控器（18），在电控器（18）上设有显示屏（19）、指示灯（20）、电源开关（21）、加热温度控制器（22）、空气压缩机控制器（23）；电控器（18）通过导线（17）与空气压缩机（15）连接。