[发明专利]一种草鱼呼肠孤病毒的间接ELISA检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗草鱼IgM的单克隆抗体、杂交瘤细胞株及草鱼呼肠孤病毒间接ELISA检测试剂盒。

背景技术

草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）隶属水生呼肠孤病毒属，为呼肠孤病毒科一新成员，是中国大陆分离的第一株鱼类病毒。该病毒主要引起中国、越南、缅甸等亚洲国家淡水养殖中的草鱼品种在鱼种阶段发生出血病，死亡率一般为 30%-50%，最高可达 60%-80%，而且还能感染青鱼、麦穗鱼、布氏餐条鱼等,并能使这几种鱼发生出血病症状而死亡，该病毒流行广、危害大、死亡率高、发病季节长，严重影响了广大养殖者的积极性和我国淡水养殖业的健康发展。草鱼呼肠孤病毒具双层衣壳，病毒粒子平均直径为60 nm-70nm，二十面体对称，无囊膜，基因组由11条分节段的双链RNA组成。目前己经报道了20多个分离株，包括GCRV854、GCRV861、GCRV873、GCRV875、GCRV876、GCRV991、H962、ZV-8802、GCHV-854、GCRV HZ08、JX09-01、GCRV-104、GD10等，不同分离株在基因组序列、基因组带型、细胞病变、对草鱼的致病力等方面差异较大。草鱼呼肠孤病毒至今还没在血清学或者基因型上对其进行系统分类。根据现有的分离株序列信息，进行核苷酸序列与氨基酸序列比对以及构建系统进化树分析，所有毒株总体上可以分为3大类，分为3个基因型，即GCRVⅠ型（代表株为GCRV-873与GCRV-JX09-01）、GCRVⅡ型（代表株为GCRV-HZ08与GCRV-GD10）和GCRV Ⅲ型(GCRV-104，GCRV-HB1007)。当前，全国各地分离到的流行株中，三类亚型均有报道，有的单独感染，也有混合感染。通过我们2009年至2013年这4年的草鱼出血病监测和流行病学调查分析表明，目前导致草鱼出血病流行和爆发的最主要为GCRV Ⅱ型。因此，对GCRV Ⅱ型病毒引起的草鱼出血病的特异性诊断具有重要意义。

草鱼呼肠孤病毒的检测方法有多种，各具优势和缺陷，病毒分离、电镜观察、核酸带型分析至今仍是检测草鱼呼肠孤病毒普遍采用的方法，但这些方法法费时费力、操作比较复杂，不能对病毒进行快速诊断，不利于草鱼出血病的流行病学调查工作。全病毒诊断涉及病毒培养、纯化及浓缩等过程，不仅制作过程复杂，耗时，成本较高，而且还潜在散毒危险，因此不利于推广使用。当前，对于草鱼呼肠孤病毒的检测，最为常用的方法是基于PCR扩增技术的各种分子生物学检测方法，包括常规的RT-PCR和荧光定量PCR等，具有较高的敏感性和特异性。但这些分子生物学方法都是检测病毒的核酸存在与否，方法单一，经常导致假阳性和假阴性结果，难于对该病做到确诊。因此，急需其它方法来弥补分子生物学检测方法的不足，如各种免疫学（血清学）检测方法。

至今为止，对于草鱼出血病的防治，还没有特异有效的治疗药物和方法，最为有效的办法仍然是注射疫苗，进行免疫预防。目前，针对草鱼出血病的疫苗，无论是法规许可的细胞弱毒疫苗还是市场上流行的土法疫苗，甚至一些细胞灭活疫，绝大部分都是针对GCRV Ⅱ型的疫苗。而对这些疫苗免疫效果的评价，只是根据免疫草鱼的死亡率来初步估计，一旦其它疫病的爆发导致免疫草鱼死亡，就无法弄清是由于疫苗效果不好，草鱼出血病依然爆发导致而的死亡，还是由于其它疫病的爆发而导致的死亡，更无法对疫苗免疫效果进行评价。因此，也急需要一种检测GCRV特异性抗体的免疫学方法。

发明内容

我们的最近研究发现：GCRV-HZ08株S10基因（SEQ ID NO:1）的编码蛋白（SEQ ID NO:2）为结构蛋白，且比GCRV其它结构蛋白诱导免疫动物产生更高效价的特异性抗体，具有更好的免疫原性；针对S10编码蛋白的抗体可以特异性识别GCRV Ⅱ型毒株，并对该类型毒株具有很强的中和能力；因此，可以利用S10基因编码蛋白来捕获机体中的特异性抗体，从而实现特异性抗体的检测。

因此，本发明的一个目的在于提供一株杂交瘤细胞株S467，已于2013年12月10 日保藏于中国典型培养物保藏中心（CHINA CENTER FOR TYPE CULTURE COLLECTION），地址：武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO: C2013193。

本发明的另一个目的是提供一种由上述保藏编号为CCTCC NO: C2013193的杂交瘤细胞株分泌产生的抗草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型的单克隆抗体。

本发明的另一个目的是提供一种草鱼呼肠孤病毒间接ELISA检测试剂盒。

本发明所采取的技术方案是：