[发明专利]检测食品中乳酸菌的方法及检测用引物

说明书

技术领域

本发明属于核酸检测领域，具体而言，本发明涉及食用乳酸菌检测的方法以及其中所使用的引物对等。

背景技术

乳酸菌是一群形态、代谢性能和生理学特征不完全相同的革兰氏阳性菌。由于具有许多有益的代谢特征，被广泛用于轻工业、食品、医药及饲料工业等许多行业上。目前在自然界中已发现的乳酸菌在细菌分类学上划分为23个属，常用于微生态制剂的菌种有双歧杆菌、乳酸杆菌、乳酸球菌、肠球菌、链球菌、明串珠菌、片球菌和地衣芽孢杆菌等。

多数乳酸菌通常被认为是安全的，因此相应的检测标准不完善，所以对乳酸菌的检测一致为人所忽视。目前市场上销售的含乳酸菌制品，仅在标签中列明菌种名称，缺乏一些具体的菌种信息，甚至部分菌种名称是厂家自行命名的，与国际标准数据库的信息无法对应，也就无法溯源，更不用提相应产品质量的稳定性。尤其是，近来的一些研究表明，部分乳酸菌也可能致病(参见刘小青，等.乳酸菌的安全性研究.中国微生态学杂志，21(10)：952-955)。因此，本发明人认为，在食品安全日益引起重视的今天，确定食品生产厂家所用乳酸菌的菌种、菌株及其所内在决定的稳定性和安全性是非常有必要的。

要保证乳酸菌及其制剂的安全性和质量，需要对其菌“株”在投产前进行生物学、遗传学特征的检测，以便核实其安全性。由于即使菌株进行保藏、培养，通常也难以分辨。而最有效的检测方法是DNA测序，但是由于含乳酸菌制品成分复杂，往往是多种乳酸菌的混合物，直接测序的干扰严重；分离菌株并培养后再测序，耗费的时间长。更为严重的是，DNA测序的成本较高，厂家和食品监督机构日常使用的成本太高，不易施行，即使制定相应方法也难以大面积实施，使得该方法形同虚设。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供新的检测食品中乳酸菌的方法，其能够对含一种或多种乳酸菌的制品进行检测，检测结果可以有效排除假阳性。另外，本发明还提供了该方法中所用的引物或引物对及其应用等。

具体而言，在第一方面，本发明提供了检测食品中乳酸菌的方法，其包括，

(1)提取食品中乳酸菌基因组DNA；

(2)对步骤(1)提取的DNA进行PCR扩增，其中所使用的引物对是兼并引物对；

(3)将步骤(2)的PCR扩增的产物进行电泳检测；如检测到唯一PCR扩增条带，则检测结果为阳性，否则检测结果为阴性；如检测结果为阳性则不需要进行步骤(4)，如检测结果为阴性则需要进行步骤(4)；

(4)任选对步骤(2)的PCR扩增的产物进行测序。

在本发明的具体实施方式中，食品是酸奶。

优选在本发明的第一方面的方法中，乳酸菌是嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、嗜热乳链球菌、保加利亚乳杆菌、双歧乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳酸菌、两歧双歧杆菌、乳双歧杆菌和长双歧杆菌中的一种或多种。

在本发明中，兼并引物对指的是引物对中的正向和／或反向引物中至少有一条是兼并引物。在本发明中，兼并引物是本领域技术人员来说是熟知的，即引物的至少有一个位置上具有两种或两种以上核苷酸。在核酸合成仪顺序合成引物的过程中，通过当要合成具有两种或两种以上核苷酸的位置时，同时加入该两种或两种以上核苷酸即可。这对于本领域技术人员来说是完全能够合成的，并且有商业化的公司提供合成服务。优选在本发明的第一方面的方法中，引物对中的引物选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10。

更优选在本发明的第一方面的方法中，引物对中的正向引物选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；和／或，引物对中的反向引物选自SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10。

优选地，步骤(2)中，所述PCR扩增的体系采用Takara DRR006A Ex Taq Hot Start Version试剂盒，如下：

TaKaRa Ex Taq HS(5U／μl)0.25μl

10×Ex Taq Buffer(Mg²⁺Plus)5μl