[发明专利]新型假丝酵母菌RNA提取试剂及其使用方法

权利要求书

1.一种新型假丝酵母菌RNA提取试剂，其特征在于，试剂由氯仿，70%乙醇，其中70%乙醇为无RNase去离子水配置而成，山梨醇，乙二胺四乙酸二钠盐/40mL水溶液，沙堡罗培养基，β-巯基乙醇，溶壁酶，异丙醇、Trizol液、RNase-Free水构成。

2.根据权利要求1所述的一种新型假丝酵母菌RNA提取试剂的使用方法，其特征在于，其步骤如下所示：

Q1：样品处理步骤:菌株准备：以无菌接种环挑取方式，将保存的纯化菌株，接种于沙堡罗培养基上，37℃过夜培养备用；

Q2：样品处理步骤:细胞悬液：将步骤Q1中得到的37℃过夜培养的相同量白假丝酵母菌菌落，溶于山梨醇、EDTA的混合液体中，使悬液细胞浓度OD600在0.6～1.0范围内；

Q3:将上述Q2步骤中得到的菌悬液置于离心管中，加入β-巯基乙醇和溶壁酶，25℃培养24小时至溶液看起来清亮；

Q4：将上述Q3步骤中得到的清亮溶液置于4℃环境中，以5000转/分钟的速率，离心5分钟，弃上清部分，得到白色细胞团，加入Trizol液，氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置2分钟；

Q5：将上述Q4步骤中得到的溶液，在4℃环境中，以12,000转/分钟的速率，离心10分钟，将上层水相移到一个新的无RNase离心管中；

Q6：将上述Q5步骤中得到的水相溶液中加入等体积的异丙醇，混匀，静置10分钟，以12,000转/分钟的速率，离心10分钟，弃上清部分；

Q7：将上述Q6步骤中得到的溶液加入到收集管的吸附柱中，以12,000转/分钟的速率，离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

Q8：向吸附柱中加入70%乙醇，以12,000转/分钟的速率，离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

Q9：重复步骤Q8，然后将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干；

Q10：将吸附柱置于一个新的无RNase离心管中，向吸附柱的中间部位加入RNase-Free水，室温放置1分钟，以12,000转/分钟的速率，离心1分钟，以收集RNA溶液，并在-70℃环境中保存RNA，防止降解。

3.根据权利要求2所述的一种新型假丝酵母菌RNA提取试剂的使用方法，其特征在于，所述步骤Q2中的山梨醇、EDTA的混合液体具体混合比例为：7.28克山梨醇、1.48克乙二胺四乙酸二钠盐，溶于40mL水溶液。

4.根据权利要求2所述的一种新型假丝酵母菌RNA提取试剂的使用方法，其特征在于，所述步骤Q3中的加入β-巯基乙醇，具体为0.1%β-巯基乙醇，即4.5μLβ-巯基乙醇/4mlddH₂O。

5.根据权利要求2所述的一种新型假丝酵母菌RNA提取试剂的使用方法，其特征在于，具体实施步骤为：

Q1：样品处理：

Q11:：菌株准备:以无菌接种环挑取方式，将保存的纯化菌株接种于沙堡罗培养基上，取3-5个菌落，在37℃过夜培养备用；

Q12:细胞悬液准备：将步骤Q11得到的37℃过夜培养的相同量白假丝酵母菌菌落溶于7.28克山梨醇、1.48克乙二胺四乙酸二钠盐与40mL水溶液混合的溶液中，使悬液细胞浓度OD600在0.6～1.0；

Q2：将Q1步骤得到的上述细胞悬液置于1.5ml离心管中加入0.1%β-巯基乙醇，即按照4.5μLβ-巯基乙醇/4mlddH2O和50个单位溶壁酶，25℃培养24小时至溶液看起来清亮；

Q3：将Q2步骤得到的清亮溶液置于4℃，以5000r/min速率，离心5min，弃上清部分，得到白色细胞团后，加入1mlTrizol液和200μL氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置2分钟；

Q4：在4℃环境中，以12,000rpm速率进行离心10分钟，将上层水相移到一个新的RNase-Free离心管中；

Q5：在得到的水相溶液中加入等体积的异丙醇，混匀，静置10分钟，以12,000rpm速率进行离心10分钟，弃上清部分；

Q6：将Q5步骤所得溶液全部加入到收集管的吸附柱中，以12,000rpm速率进行离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

Q7:向Q6步骤中的吸附柱中加入200μl乙醇，12,000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

Q8:向Q7步骤中的吸附柱中加入200μl乙醇，12,000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干；

Q9:将Q8步骤中的吸附柱置于一个新的无RNase离心管中，向吸附柱的中间部位加入30-50μl RNase-Free水，室温放置1分钟，12,000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，于-70℃环境中保存RNA，防止降解。