[发明专利]新型假丝酵母菌RNA提取试剂及其使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及医学分子生物学技术领域，特别涉及一种新型假丝酵母菌RNA提取试剂及其使用方法。

背景技术

假丝酵母菌（Candida Albicans），亦称念珠菌，可侵犯皮肤、粘膜和内脏，表现为急性、亚急性或慢性炎症，大多为继发性感染。假丝酵母菌种类很多，但能对人致病的仅有几种，以白假丝酵母菌（C.albicans）即白色念珠菌最常见，致病力也最强，其次为热带假丝酵母菌（C.tropicalis），其它还有克柔假丝酵母菌（C.krusei）、近平滑假丝酵母菌（C.parapsilokis）和伪热带假丝酵母菌（C.pseudotropicalis）等。

假丝酵母菌的主要特征是细胞呈球形、椭圆形、圆筒形、长条形，有时为不规则形；通过发芽而繁殖，可形成假丝菌，少数形成厚膜孢子及真菌丝。假丝酵母菌为酵母型真菌，芽生酵母在特定条件下转为菌丝后则致病力增强。

对假丝酵母菌RNA提取，然后进行研究，是现代医学技术中非常重要的研究方法与手段，现有技术中，对假丝酵母菌分子生物学水平的研究常常需提取其总RNA，目前常用的假丝酵母菌破壁提取方法有：-80℃研磨破壁法、液氮研磨破壁法、酸洗玻璃珠破壁法、Trizol法、改进Trizol法、超声粉碎法、热酚法及改良的热酚法、反复冻融法等，也有少部分学者使用过蜗牛酶破壁法。在这些方法中，超声波法和玻璃珠漩涡振荡会打断RNA链，形成小分子RNA，不适于后续的分子生物学试验要求。热酸性酚法耗时长，所用试剂多且实验中加入的酚类物质不易除去，最终易与RNA形成褐色复合物而导致RNA完全丧失生物学活性。而氮研磨法、反复冻融法等常用破壁方法虽然效果较好，但操作步骤繁琐，不适于大量样本RNA的提取。与本申请提案最为接近的技术方案为Trizol法，该方法对实验结果影响很大，Trizol法在提取白色念珠菌RNA之前往往无法充分破坏假丝酵母菌细胞壁，使提取出的RNA十分不纯，残存有蛋白质、无机盐离子及大量有机杂质等，需要后续大量的工作才能够进行应用，因而无法获得高质量的总RNA，浪费了大量的人力物力。

发明内容

针对现有技术方法对假丝酵母菌RNA提取影响很大、提取出的RNA残存有蛋白质、无机盐离子及大量有机杂质等上述缺陷和问题，本发明实施例的目的是提供一种可靠性更好的新型假丝酵母菌RNA提取试剂及其使用方法，破壁液破壁充分，对实验结果影响较小，利用离心吸附柱进行RNA的洗涤，可以有效除去蛋白质、无机盐离子及有机杂质等。

为了达到上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

一种新型假丝酵母菌RNA提取试剂，其特征在于，试剂由氯仿，70%乙醇，其中70%乙醇为无RNase去离子水配置而成，山梨醇，乙二胺四乙酸二钠盐/40mL水溶液，沙堡罗培养基，β-巯基乙醇，溶壁酶，异丙醇、Trizol液、RNase-Free水构成。

作为上述技术方案的优选，本发明提供一种新型假丝酵母菌RNA提取试剂的使用方法，其步骤如下所示：

Q1：样品处理步骤:菌株准备：以无菌接种环挑取方式，将保存的纯化菌株，接种于沙堡罗培养基上，37℃过夜培养备用；

Q2：样品处理步骤:细胞悬液：将步骤Q1中得到的37℃过夜培养的相同量白假丝酵母菌菌落，溶于山梨醇、EDTA的混合液体中，使悬液细胞浓度OD600在0.6～1.0范围内；

Q3:将上述Q2步骤中得到的菌悬液置于离心管中，加入β-巯基乙醇和溶壁酶，25℃培养24小时至溶液看起来清亮；

Q4：将上述Q3步骤中得到的清亮溶液置于4℃环境中，以5000转/分钟的速率，离心5分钟，弃上清部分，得到白色细胞团，加入Trizol液，氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置2分钟；

Q5：将上述Q4步骤中得到的溶液，在4℃环境中，以12,000转/分钟的速率，离心10分钟，将上层水相移到一个新的无RNase离心管中；

Q6：将上述Q5步骤中得到的水相溶液中加入等体积的异丙醇，混匀，静置10分钟，以12,000转/分钟的速率，离心10分钟，弃上清部分；

Q7：将上述Q6步骤中得到的溶液加入到收集管的吸附柱中，以12,000转/分钟的速率，离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

Q8：向吸附柱中加入70%乙醇，以12,000转/分钟的速率，离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

Q9：重复步骤Q8，然后将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干；