[发明专利]单克隆抗体及其应用、试剂盒、检测银杏叶水溶性蛋白含量的Dot-ELISA方法

说明书

技术领域

本发明涉及药物制剂检测领域，特别涉及单克隆抗体及其应用、试剂盒、检测银杏叶水溶性蛋白含量的Dot-ELISA方法。 

背景技术

脑梗死又称缺血性卒中，中医称之为卒中或中风，它是由各种原因所致的局部脑组织区域血液供应障碍，导致脑组织缺血缺氧性病变坏死，进而产生临床上对应的神经功能缺失表现。脑梗死依据发病机制的不同分为脑血栓形成、脑栓塞和腔隙性脑梗死等主要类型。其中脑血栓形成是脑梗死最常见的类型，约占全部脑梗死的60%。脑梗死的临床表现主要有偏瘫、失语、意识障碍等，致残率高，给患者带来极大的痛苦，给家庭及社会带来沉重的经济负担，因此，如何有效预防和治疗脑梗死依然是现代医学研究的热点。 

银杏二萜内酯葡胺注射液是用于治疗脑梗死的药物，主要功效为活血通络，用于轻中度脑梗死恢复期痰瘀阻络症（症状如半身不遂，口舌歪斜，言语蹇涩，肢体麻木等）。银杏二萜内酯葡胺注射液是以银杏叶为原料，经提取纯化后得到，其有效成分为银杏二萜内酯，银杏二萜内酯包括银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯K等。 

由于中药注射制剂中有效成分是经过生物提取的方式获得，具有生物提取物的特征，在提取的过程中不可避免地带有一些生物大分子，比如植物蛋白质、核酸等，而蛋白质是抗原性最强的常见物质，且蛋白质的分子量越大抗原性越强，越容易引起过敏反应或类过敏反应。如果中药注射制剂的活性成分在提取过程中纯化不完全，中药注射制剂成品中带有蛋白质杂质，致使中药注射制剂产品的质量不合格，注射入患者体内易引起过敏反应。因此，控制银杏二萜内酯葡胺注射液中水溶性蛋白含量，对于提高银杏二萜内酯葡胺注射液的质量至关重要。目前，银杏二萜内酯葡胺注射液的质量控制方面多以高效液相色谱法（HPLC）和磺基水杨酸沉淀法检测为主。高效液相色 谱法需使用精密仪器，费时长，不适合大批量样品的快速测定；磺基水杨酸沉淀法对蛋白质产生可见沉淀（混浊）的检测限约为25μg/mL，而低于此限量的蛋白质也能够引发过敏反应。因此，提供一种检测限低，灵敏度高，准确性好，操作简便，适于大批量样品检测的检测方法，用于银杏二萜内酯葡胺注射液中水溶性蛋白的检测，具有重要的现实意义。 

发明内容

有鉴于此，本发明提供了单克隆抗体及其应用、试剂盒、检测银杏叶水溶性蛋白含量的Dot-ELISA方法。该Dot-ELISA方法检测银杏叶水溶性蛋白的最低检出量为9.75ng，检测的灵敏度远远高于ELISA方法，且操作时间短。 

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案： 

本发明提供了一种银杏叶水溶性蛋白的单克隆抗体，由保藏号为CGMCC NO：8654的杂交瘤产生。 

该杂交瘤于2013年12月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏中心地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO：8654。 

本发明还提供了该单克隆抗体在制备检测银杏叶水溶性蛋白含量的试剂盒中的应用。 

本发明还提供了一种检测银杏叶水溶性蛋白含量的试剂盒，包括本发明提供的单克隆抗体；该单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO：8654的杂交瘤产生。 

本发明还提供了一种检测银杏叶水溶性蛋白含量的Dot-ELISA方法，包括如下步骤： 

获得待测样品； 

获得银杏叶水溶性全蛋白； 

取硝酸纤维素膜，划分出第一阴性对照区、第一阳性对照区和第一检测区，经饱和、第一干燥，获得第二阴性对照区、第二阳性对照区和第二检测区； 

以磷酸盐缓冲液、银杏叶水溶性全蛋白、待测样品作为抗原，取磷酸盐 缓冲液、银杏叶水溶性全蛋白、待测样品分别包被于第二阴性对照区、第二阳性对照区、第二检测区，经第二干燥、封闭、洗涤、第三干燥，获得抗原膜片；银杏叶水溶性全蛋白的最低包被量为9.75ng； 

以本发明提供的单克隆抗体作为第一抗体，以酶标记的羊抗鼠IgG作为第二抗体，取第一抗体与抗原膜片结合，获得第一抗体-抗原膜片；取第二抗体与第一抗体-抗原膜片结合，显色，终止显色，观察检测区是否出现斑点用以检测待测样品中银杏叶水溶性蛋白含量； 

检测区出现斑点，则待测样品中银杏叶水溶性蛋白含量大于或等于9.75ng； 

检测区未出现斑点，则待测样品中银杏叶水溶性蛋白含量小于9.75ng。