[发明专利]检测外周血游离DNA的试剂盒及寡核苷酸

权利要求书

1.一组检测外周血游离DNA的寡核苷酸，其特征在于，由序列表SEQ ID No.1至序列表SEQ ID No.4所示碱基序列的寡核苷酸组成；其中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2分别为扩增LINE-1基因的上、下游引物，SEQ ID No.3和SEQ ID No.4分别为扩增Alu基因的上、下游引物。

2.一种检测外周血游离DNA的试剂盒，其特征在于，由以下组分组成：

1）酶切反应液，其包括：HpaII酶，10×buffer；

2）qPCR反应液，其包括：扩增LINE-1基因的上游引物和下游引物，扩增Alu基因的上游引物和下游引物，和含有SYBR Green的PCR反应液；

其中，扩增LINE-1基因的上游引物和下游引物分别是SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，扩增Alu基因的上游引物和下游引物分别是SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；

3）制备标准曲线的DNA标准品；

4）阴性对照DNA样品；

5）阳性对照DNA样品；

6）ddH₂O。

3.一种检测外周血游离DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）抽提外周血游离DNA；

2）使用HpaII酶对外周血游离DNA进行酶切；

3）进行实时荧光PCR定量扩增，其中，使用的引物为序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的扩增LINE-1基因上、下游引物，和序列表SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的扩增Alu基因的上、下游引物；

4）结果判定，按照如下公式计算

(a)血浆游离DNA中Alu的绝对浓度：根据标准曲线测定血浆游离DNA中Alu的绝对浓度；

(b)△Ct=∣(Ct-L1precut–Ct-Aluprecut)∣；

(c)△△Ct=∣(Ct-L1precut–Ct-Aluprecut)—(Ct-L1postcut–Ct-Alupostcut)∣；

其中，血浆游离DNA中Alu的绝对浓度小于2.5ng/ml为阴性；△Ct值大于3.2为阴性;△△Ct值小于0.8为阴性。