[发明专利]检测外周血游离DNA的试剂盒及寡核苷酸

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用外周血游离DNA进行肿瘤筛查、疗效评估以及预后预测的试剂盒。属生物技术领域。

背景技术

早期诊断、早期治疗是提高肿瘤临床治愈率和改善预后的关键，肿瘤标志物的鉴定与应用是决定早期发现以及疗效评估的关键因素。现今使用的大多数肿瘤标志物都是代谢相关的糖蛋白，通常是通过免疫测定技术进行检测的，临床资料显示，目前临床应用的蛋白类肿瘤标志物一方面并非在所有肿瘤中均表现异常，在没有这些标志物异常的肿瘤患者中，对其治疗的有效性将无法通过简易的外周血检测进行评价，只能通过影像学手段进行检查（承受射线辐射），难以进行实时的疗效评估；另一方面常规的蛋白类肿瘤标志物的通常敏感性较低，一些肿瘤中这些标志物通常滞后于肿瘤的发生，需要进行多指标组合检测，增加的检测的时间与费用；因而在癌症早期的筛查时受到了极大限制，这样就迫切需要寻找更为敏感的标志物。

外周血游离DNA是由细胞死亡后释放到血液中细胞外DNA的总称，研究发现，许多肿瘤患者游离DNA与正常人相比有很大差异，正常人外周血中游离DNA主要来自凋亡的细胞，由细胞核DNA和线粒体DNA组成，其含量极其微弱，通常每毫升仅为纳克水平，而肿瘤患者血液循环中游离DNA水平却显著高于正常人，目前发现，外周血游离DNA含量增高是各类肿瘤生长过程中的一种普遍现象；同时在正常人中，正常细胞死亡的方式通常是凋亡，释放到外周血中的DNA片段一般较短（200bp以下），而在肿瘤患者中，肿瘤细胞常死亡主要是坏死，而坏死细胞所释放到外周血中的DNA通常表现为不同的长度，这样相对于正常人，肿瘤患者外周血游离DNA中长片段DNA的含量也将会增加；另外，在肿瘤细胞来源与正常细胞来源的DNA中，某些靶基因的表观遗传学修饰（甲基化）有显著的不同。尤其需要提及的是血浆游离DNA在体内的代谢速度非常快，半衰期仅数分钟，可实时反映患者的状况。据此可通过外周血DNA的检测对肿瘤疗效以及预后进行评估。其在对高危险个体的筛检（肿瘤早期诊断）、疾病分期也具有重要的意义，是一种方便、快捷、敏感、特异的检测手段。同时基于循环DNA检测无创伤性，避免了常规检测需要采集癌组织标本的困难，非常适合对疗效的动态观察与评估，总之，外周血游离DNA的检测正以其不可替代的优势逐渐被人们所重视，并正在成为肿瘤应用研究的焦点。

由于外周血游离DNA相对于组织样本非常微量，这样一方面需要选择基因组中高拷贝的DNA序列，另一方面也需要选择高灵敏度的检测方法。Alu序列以及LINE-1序列是基因组中高拷贝的重复序列，目前的研究显示，LINE-1仅在肿瘤细胞以及细胞应激状态下激活，而在正常细胞中处于沉默状态，这种变化主要是通常表观遗传学修饰实现的，即LINE-1的激活体现在其启动子的去甲基化，而沉默则体现在其启动子的超甲基化。所以通过对其启动子区域的甲基化水平变化的检测，可评估其激活与否。

本试剂盒通过设计LINE-1启动子区域中包含CG岛的靶序列（含有甲基化敏感的限制性内切酶的作用位点），在其两侧的高保守区域设计PCR引物，同时选取Alu序列作为内参，选择区域中不包含有上述甲基化敏感的限制性内切酶的作用位点，设计PCR引物，两种扩增产物经序列分析进行证实。这样理论上正常细胞来源的LINE-1启动子序列由于高甲基化，甲基化敏感的限制性内切酶则不能切开，表现为酶切前后PCR扩增的Ct值没有明显的差异，而肿瘤细胞来源的LINE-1启动子序列由于出现去甲基化，甲基化敏感的限制性内切酶则可以切开，表现为酶切前后PCR扩增的Ct值有明显的增加。同时由于设计的LINE-1扩增片段（256bp）与Alu（112bp）扩增片段长度差别较大，其Ct值差值可以作为评估外周血游离DNA长度变化的重要指标。另外Alu序列由于在基因组中的拷贝数很高，其浓度的变化也反映出了血浆游离DNA总浓度的变化。所以通过对以上三种指标的检测可敏感的反映出肿瘤的有关信息，对肿瘤早期预警的筛查、疗效评估以及预后预测的应用具有重大的指导意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一组特异性强、灵敏度高的用于检测外周血游离DNA的寡核苷酸。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种操作简单、结果准确的检测外周血游离DNA的试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一组检测外周血游离DNA的寡核苷酸，由序列表SEQ ID No.1至序列表SEQ ID No.4所示碱基序列的寡核苷酸组成；