[发明专利]一种利用焦磷酸测序技术检测小反刍兽疫病毒的试剂盒

权利要求书

1.一种适用于焦磷酸测序检测小反刍兽疫病毒N基因的特异目标序列，其具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

2.用于检测小反刍兽疫病毒N基因的通用引物，其核苷酸序列为：

UPPRVF：5’-ACCCTCGTGAGGCTCAAA-3’

UPPRVR：5’-Biotin-CCTCCTGGTCCTCCAGAATC-3’。

3.与权利要求2所述通用引物配合使用的焦磷酸测序引物，其核苷酸序列为：

UPPRVS：5’-ATCGGCTGAGGCACT-3’。

4.一种利用焦磷酸测序技术检测小反刍兽疫病毒的试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述的通用引物和权利要求3所述的焦磷酸测序引物。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，其工作程序为：

（1）提取待测样品的RNA；以权利要求2所述的通用引物进行RT-PCR扩增；

（2）若扩增产物长度为78bp，则制备焦磷酸测序单链模板；

（3）进行焦磷酸测序，若目的序列与权利要求1所述特异目标序列一致，则待测样品中含有小反刍兽疫病毒。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，步骤（1）的RT-PCR50μL反应体系中含10×One Step RNA PCR Buffer5μL，25mmol/L MgCL₂10μL，dNTP Mixture各10mmol/L5μL，40U/μL RNA酶抑制剂1μL，5U/μL AMV反转录酶XL1μL，5U/μL AMV-Optimized Taq1μL，10pmol/μL上、下游引物各1.0μL，待测RNA1μg，无RNA酶H₂O补足50μL反应体系。

7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，步骤（1）的RT-PCR扩增条件为：50℃反转录30min，94℃预变性2min后；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共循环50次；然后72℃再延伸8min。

8.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，步骤（1）中RT-PCR扩增产物电泳检测方法为取0.6g琼脂糖，于30mL1×TAE电泳缓冲液中加热，充分熔化，加入SYBR Green10000倍稀释的溶液2μL，制胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶；取5μLRT-PCR扩增产物分别和1μL6×Loading Buffer混合后，点样；10V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部，停止电泳，将凝胶置于紫外凝胶成像系统下观察电泳结果并记录。

9.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，步骤（2）的制备焦磷酸测序单链模板方法为：使用20μL标记有生物素的PCR产物与30μL ddH₂O混合后再与200μg链霉素亲和素包被的磁珠混合，室温下置震荡器上1400rpm震荡孵育15min，用真空吸附泵将与磁珠结合后的PCR产物吸起，然后依次通过70%乙醇5s；变性缓冲液5s；冲洗缓冲液5s，最后移至预先每孔加入45μL含有0.3mol/L测序引物的结合缓冲液的96孔板上方，释放磁珠，将96孔板放入80℃烘箱中加热2min后，取出冷却至室温。

10.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，步骤（3）焦磷酸测序反应在20-28℃下于焦磷酸测序仪上进行检测，所采用的碱基加入顺序为15（ATGC），每轮测序检测运行时间为65min，引物链随着不同dNTP的加入而延伸，随着核酸的结合，CCD摄像机检测到发出的光信号，读出DNA序列。