[发明专利]一种利用焦磷酸测序技术检测小反刍兽疫病毒的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及焦磷酸测序技术，特别是涉及利用焦磷酸测序技术检测小反刍兽疫病毒的试剂盒。

背景技术

小反刍兽疫(Peste des petits ruminants，PPR)是由副粘病毒科麻疹病毒属的小反刍兽疫病毒（PPRV）引起的一种高度接触性动物疫病。该病主要感染家养和野生小反刍兽，山羊尤其易感，其致病性与分子学特性与牛瘟（RP）非常相似，被世界动物卫生组织（OIE)规定为A类动物疫病，给发生该病的国家，尤其是非洲、中东、近东和南亚等国家的外贸经济带来了巨大的损失。该病自发生以来，不断向世界各地蔓延，对无该病发生的国家，尤其对呈地方性流行国家的临近国家造成的威胁逐渐加大。长期以来，人们一直认为PPRV是RPV的变异毒株，只是丧失了对牛的致病力，只对小反刍动物有致病作用，加上RP和PPR能够产生交叉免疫保护，可以用RP疫苗预防PPR。因此，在很多国家和地区忽略了对PPR的研究，特别是忽视了PPRV的病原生物学、分子生物学等方面的研究。本病目前没有有效的治疗方法，只能依靠有效地预防，因此诊断监测技术成为控制该病的重要手段。

焦磷酸测序技术（Pyrosequencing）是近几年发展起来的一种能够进行定量序列测定的新技术，具有高通量、快速、敏感等特点。目前该技术在物种鉴定、病毒的快速鉴定和分型、微生物的检测以及寄生虫检测鉴定等方面已有广泛的应用。

焦磷酸测序是不同于Sanger法的一种新的测序技术，它以单链DNA为模板，在荧光素、5′-磷酸化硫酸腺苷（APS）等底物存在，及DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸酶（ATP sulfurylase）、重组荧光素酶（luciferase）催化下，加入与模板互补的dNTP时发生延伸反应，产生与模板碱基数相应强度的荧光信号，不互补的dNTP被三磷酸腺苷双磷酸酶（apyrase）降解，无荧光信号产生。焦测序无需荧光染料标记和电泳步骤，能够在短时间内提供基因片段的序列信息，是短片段基因测序的理想平台。焦测序技术已经在SNP检测，微生物分型，基因甲基化检测等领域得到应用，还应用到大规模DNA测序中，使测序技术发生了革命性变化。

发明内容

本发明的目的在于克服现有检测技术的不足，提供一种小反刍兽疫病毒通用焦磷酸测序检测方法，以弥补现有检测技术的不足，为我国畜牧业和养殖业、畜产品加工和出口商以及国际畜产品贸易等方面提供一种快速、简便、高效、实用的检测方法。

为了实现上述目的，本发明的主要原理是利用焦磷酸测序技术，通过DNA聚合酶（DNA ploymerase）、三磷酸腺苷硫酸化酶（ATP sulfurylase）、荧光素酶（luciferase）和双磷酸酶（apyrase）4种酶催化待测序DNA单链和测序引物的酶级联化学发光反应，反应底物为5’-邻酰硫酸（adenosine5’phosphosulfate，APS）和荧光素。在每一轮测序反应中，加入1种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团（PPi）。硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，后者驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化，发出与ATP量成正比的可见光信号，光信号由CCD摄像机检测并由Pyrogram^TM反应为峰，每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。ATP和未掺入的dNTP由双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。然后加入下一种dNTP。最终待测序列顺序即可从反应光强的信号峰中读出。

本发明的另一目的在于提供用于检测小反刍兽疫病毒的试剂盒。

本发明首先提供的一种适用于焦磷酸测序检测小反刍兽疫病毒N基因的特异目标序列，其具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

本发明提供了用于检测小反刍兽疫病毒N基因的通用引物，其核苷酸序列为：

UPPRVF：5’-ACCCTCGTGAGGCTCAAA-3’

UPPRVR：5’-Biotin-CCTCCTGGTCCTCCAGAATC-3’。

本发明提供了与上述通用引物配合使用的焦磷酸测序引物，其核苷酸序列为：

UPPRVS：5’-ATCGGCTGAGGCACT-3’。