[发明专利]一种转基因材料来源食用油的分子检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种转基因植物油的分子检测方法。

背景技术

随着基因工程技术的发展，转基因农作物以其良好的抗逆性、高产量、相对较低的生产成本，很快占据了世界市场，实现了其市场化和商品化。然而这些转基因作物及其食品对生态环境及人类健康是否安全，始终是公众关切的大问题。据此，国际和国内先后出台了转基因农产品标识管理政策，以保护消费的知情权和选择权。按照2002年中国农业部出台的相关规定，我国市场上的转基因食用油必须进行明确标识。为此就需要有与之相配的转基因食用油的检测方法。而油脂因为已经经过压榨或者萃取分离，其中DNA的成分很少，且结构不完整，难以适用通用的DNA检测技术。PCR技术由于其高效性和灵敏性成为转基因食品的最常用检测方法。目前，市场上大豆和玉米等作物的转基因技术都是采用35S启动子和目的基因同时转入的策略，国际通用的方法也是以PCR技术为平台，通过特异扩增转基因调控原件花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子、胭脂碱合酶NOS终止子以及目的基因抗除草剂基因CP4-EPSPS来筛选检测转基因食品。但食用油经过高温、高压、萃取等步骤高度精炼以后，核酸严重破坏，含量极低，提取非常困难，因此如何高效提取精炼油中的DNA始终是转基因检测的瓶颈难点。尽管油脂中转基因成分的检测已有相关国家标准出台，但周红霞等通过多次实验发现，标准中介绍的方法并不能完全有效地提取出油脂中的DNA。他们参照并改进前人介绍的方法 ，用CTAB法加核酸富集处理步骤，从15-20ml的油样中提取到了能够用于后续PCR检测的DNA,提高了DNA提取的有效性，但PCR扩增产物的电泳检测效果不佳，可能是由于提取到的核酸量非常少而影响了PCR的扩增效果。在前人研究的基础上，本发明用改进的CTAB提取试剂盒法加核酸富集处理步骤，稳定高效地提取出了大豆及玉米食用油中适用于PCR扩增的DNA, 设计并筛选出能有效扩增tRNA、18S、CaMV 35S基因片段的引物，定性检测转基因食用油，为转基因食用油DNA的提取和检测提供一种稳定有效的方法。并采用实际的烹饪温度处理食用油，验证本方法对烹饪过的植物油也同样适用。

发明内容

本发明的目的是提供一种稳定有效的转基因材料来源食用油的分子检测方法，并确证对于高温处理后的食用油检测也同样适用。

本发明提供的转基因材料来源食用油的分子检测方法，具体步骤如下：

（1）用CTAB植物基因组DNA提取试剂盒（选购自北京艾德莱生物科技有限公司）提取食用油中的微量DNA。即将食用油中的核酸富集到CTAB裂解液中，通过试剂盒操作纯化裂解液中的DNA，并将DNA储存在洗脱缓冲液EB中，存放在2-8℃；

提取的具体操作步骤为：对于某种食用油，取两支50ml的试管，每管加入2ml试剂盒中的裂解液PL以及40ml食用油，颠倒混匀， 45℃，250r/min震荡1h， 10000r/min离心5min，去油相，在水相中再加入油相40ml，重复上述操作4次，将两支试管中第4次离心后保留的水相按每管600ul分装到2ml EP管中，每管加入600ul氯仿/异戊醇(24:1)，颠倒充分混匀几分钟，13000rpm离心5min，然后按试剂盒后续操作说明进行；

（2）针对大豆和玉米的内源基因tRNA、18S、Ubiquitin、Actin设计一系列扩增不同长度片段的引物，PCR扩增提取到的油样DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出一套扩增效果最好的引物，得到tRNA、18S-1、18S-2、18S-3四对扩增食用油DNA效果最好的引物；用这四对引物检测从油样中是否提取到了可用于PCR扩增的DNA；

这四对引物为：

tRNA：  F：5’- CGAAATCGGTAGACGCTACG-3’ （SEQ.ID.NO1）

R：5’-TTCCATTGAGTCTCTGCACCT-3’ （SEQ.ID.NO2）

18S-1：  F：5’-ATGATAACTCGACGGATCGC-3’  （SEQ.ID.NO3）

R：5’-CTTGGATGTGGTAGCCGTTT-3’   （SEQ.ID.NO4）

18S-2：  F：5'-GCAAGACCGAAACTCAAAGGA-3'   （SEQ.ID.NO5）

R：5'-ACGACAGCCATGCAGCACC-3'      （SEQ.ID.NO6）

18S-3： F：5' -CTAACTCCGTGCCAGCAGC -3'     （SEQ.ID.NO7）