[发明专利]一种丙型肝炎病毒基因型检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于丙型肝炎病毒基因型检测技术领域，涉及一种丙型肝炎病毒基因型检测试剂盒。

背景技术

磁珠法是近年发展迅速且被广泛应用的一种核酸提取方法，其优于传统方法的特点可以总结为以下几点：提取体积可变性大、吸附核酸专一性强、纯度高、可实现自动化操作。

实时荧光PCR技术（FQ-PCR）把PCR、分子杂交和光化学融为一体，使PCR扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下进行。实时荧光PCR技术与其它检测技术相比具有以下优势：（1）与免疫学检测比较，具有更高的灵敏度，从理论上讲只要有一个基因拷贝就可以检测出来。（2）根据各种病原体独特的保守基因序列设计引物，能够保证PCR反应的高度特异性，避免交叉反应。（3）能对病毒进行定量检测，可反映出患者体内病原体拷贝数的高低和复制情况。定量检测有助于判断病原体感染与疾病发生和发展的关系，探讨药物对病原体的作用，了解感染性疾病病人用药后病情的变化情况。这对理解发病机制和预测抗病毒治疗的有效性十分关键。（4）可扩大检测人群的范围，适用于大规模的流行病调查。对手足口病这类自然感染率极高的病原微生物尤其适用。（5）将PCR敏感性与探针特异性相结合，在很大程度上改变了传统PCR的缺陷，缩短了反应时间，简化了操作步骤。（6）全过程均在单管封闭条件下进行，避免了由于样本间交叉引起的假阴性和环境污染。（7）实时检测技术可连续不断的检测PCR过程中荣耀信号的变化，避免了传统PCR的“平台期效应”，并且模板的定量不通过终产物，而由Ct值算出，准确性和灵敏性都有提高。

国内少有基于实时荧光定量PCR技术定量检测HCV（丙型肝炎病毒，hepatitis C virus）基因型的试剂盒应用于临床检测中，这些试剂盒所提供的HCV-RNA提取方法主要是酚-氯仿法和柱提取法。该类试剂盒存在很多不足之处：1）检测灵敏度低，约在10000IU/ml左右；检测范围窄，一般在1.00E+04IU/ml～1.00E+07IU/ml之间，对于临床高值（大于5.00E+07IU/ml）和低值（小于1.00E+04IU/ml）的样本无法检测；2）对于HCV基因型覆盖不全，只能检测其中某种基因型下的亚型；3）酚-氯仿法是最经典的RNA提取方法，但是操作繁琐，对于设备和人员操作要求高，低病毒载量的标本检出率低，且所用试剂具有一定的毒性；柱提取方法无需高速离心，但是需频繁更换离心管，用时长，特异性较差；4）无法有效去除样本中的PCR抑制物（如：血脂、强溶血等）；5）国外试剂成本和耗材成本太高，很难在临床广泛开展。

因此，目前存在的问题是针对现有丙型肝炎病毒基因型荧光定量PCR检测试剂盒的缺陷，研究开发一种覆盖型别全面、RNA提取得率高、检测灵敏度高、检测范围宽而准确的HCV基因型荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒可以对血浆等未知样本中的HCV-RNA进行快速、准确分型检测，检测结果可用于HCV分型的辅助诊断。

发明内容

本发明提供了一种丙型肝炎病毒基因型检测试剂盒。该试剂盒用磁珠法提取样本核酸，采用实时荧光定量PCR技术，以HCV基因组的高度保守区域为扩增靶目标，设计特异性引物及TaqMan探针，在实时荧光PCR仪上通过PCR扩增对HCV基因进行快速、准确分型检测。

为此，本发明一方面提供了一种丙型肝炎病毒基因型检测试剂盒，其包括3种丙型肝炎病毒PCR反应液，其中，HCV1/3型PCR反应液含有两种用于靶多核苷酸检测的探针和用于靶多核苷酸扩增的上下游引物，且所述引物和探针的序列为，

上游引物HCV1-F：5'-AGGAAGACTTCCGAGCGGTC-3'；

下游引物HCV1-R：5'-TGCCATAGAGGGGCCAAGG-3'；

探针HCV1-P：5’FAM-TACCCGGGCTGCGCCCAGG-BHQ13’；

上游引物HCV3-F：5'-GTCCTTTCTTGGAACAACCCGC-3'；

下游引物HCV3-R：5'-GACCCAACACTACTCGGCTAGTGA-3'；

探针HCV3-P：5’FAM-CAATACCCAGAAATTTGGGCGTGCC-BHQ13’；

HCV2/6型PCR反应液含有两种用于靶多核苷酸检测的探针和用于靶多核苷酸扩增的上下游引物，且所述引物和探针的序列为，

上游引物HCV2-F：5'-CGGAATTGCCGGGAAGACT-3'；

下游引物HCV2-R：5'-GCCTTTCGCAACCCAACG-3'；