[发明专利]CYP119酶表达载体及其纯化方法在审
| 申请号： | 201310744163.6 | 申请日： | 2013-12-30 |
| 公开（公告）号： | CN104745615A | 公开（公告）日： | 2015-07-01 |
| 发明（设计）人： | 王钦;张春;李静;何芳;肖星茂 | 申请（专利权）人： | 泸州医学院 |
| 主分类号： | C12N15/63 | 分类号： | C12N15/63;C12N1/21;C12N9/04;C12R1/19 |
| 代理公司： | 成都虹桥专利事务所(普通合伙) 51124 | 代理人： | 梁鑫 |
| 地址： | 646000 *** | 国省代码： | 四川;51 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | cyp119 表达 载体 及其 纯化 方法 | ||
1.含有CYP119酶编码基因的载体。
2.如权利要求1所述的载体，其特征在于：所述的CYP119酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2或SEQ ID No.4所示。
3.如权利要求1或2所述的载体，其特征在于：所述的CYP119酶编码基因的核苷酸序列为：SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示。
4.如权利要求1～3任一项所述的载体，其特征在于：所述的载体为表达载体。
5.如权利要求1～4任一项所述的载体，其特征在于：所述的载体为质粒。
6.如权利要求5所述的载体，其特征在于：所述的质粒为pET30a。
7.如权利要求6所述的载体，其特征在于：所述的pET30a的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。
8.含有权利要求1～7任一项所述载体的宿主。
9.如权利要求8所述的宿主，其特征在于：所述的宿主为大肠杆菌。
10.CYP119酶的纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：
a、取发酵后的菌液离心收集菌体，PBS悬浮菌体，破碎细胞，获得粗酶液；
b、0.22μm过滤膜过滤粗酶液，4℃下利用Ni-NTA亲和柱进行粗酶的纯化；
c、对洗脱液进行超滤膜浓缩，5000g4℃，离心60min，利用无咪唑的PBS溶液置换2次，得到纯品。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于：步骤b中的洗脱条件为：平衡液I洗脱5个柱体积；将0.22μm过滤膜过滤后的粗酶液上柱；平衡液I洗5个柱体积；平衡液II洗5个柱体积；洗脱液I洗6～10个柱体积；洗脱液II洗5个柱体积，收集洗脱液。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于：平衡液I为50mM PBS，pH7.4，5mM咪唑；平衡液II为50mM PBS，0.5M NaCl，pH7.4，5mM咪唑；洗脱液I为50mM PBS，pH7.4，20mM咪唑；洗脱液II为50mM PBS，pH7.4，80mM咪唑。
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