[发明专利]CYP119酶表达载体及其纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及CYP119酶表达载体及其纯化方法。

背景技术

CYP119酶（cytochrome P450119）来自黄石公园火山口分离的嗜酸嗜热硫矿硫叶菌（Sulfolobus solfataricus），因此该酶具耐酸抗高温等作用。目前文献报道CYP119酶在过氧化氢或假单孢氧还蛋白-还原酶（Pd/PdR）和辅酶NADPH条件下能催化月桂酸羟基化和苯乙烯环氧化的反应。其突变体T214V能明显改善与苯乙烯的结合能力，过氧化氢途径下的苯乙烯环氧化反应速率比野生型提高了近3倍。利用生物酶进行烷基的羟基化、环氧化、氧化等反应，具有高度的区域选择性和立体选择性。其催化具有反应条件温和，环境友好，选择性专一，过程高效等特点，在有机合成中应用广泛，是绿色化学发展的重要趋势，因此CYP119酶和其突变酶是有机合成中具有潜力的生物催化剂候选。

目前，国外有一些对CYP119酶进行大肠杆菌的克隆和表达的研究。如McLean等（McLean MA,Maves SA,Weiss KE,et al.Biochemical and Biophysical Research.1998,252:166-172）将该酶基因构建到PUC18载体中定名为pKS119，在E.coli TB-1细胞中进行表达。Koo LS等（Yano JK,Koo LS,Schuller DJ,et al.The journal of biological chemistry.2000,275:31086–31092）将该基因构建到pCWori载体中进行表达。Rabe KS等（Rabe KS,Kiko K,Niemeyer CM.Chemical biology chemical.2008,9:420-425）将该基因构建到Gateway系统中的pDONR221载体上在E.coli BL21（DE3）中进行表达。之前的研究在构建原核表达载体时，都用了超长的引物设计，扩增极其不便。并且目前的表达体系和方法的表达量较低，已报道的最高表达量是1L培养基12.5mg蛋白。

同时，由于CYP119酶与咪唑会有一定程度的结合，而EDTA使酶活性中心金属离子螯合，因此在进行酶的纯化中如何减少咪唑和不使用EDTA等螯合剂，不使酶变性失活是技术的关键。McLean等（McLean MA,Maves SA,Weiss KE,et al.Biochemical and Biophysical Research.1998,252:166-172）将粗酶液通过不同的浓度(NH4)₂SO₄经盐析法纯化后，溶液再过脱盐柱。Koo LS等（Yano JK,Koo LS,Schuller DJ,et al.The journal of biological chemistry.2000,275:31086–31092）报道，粗酶利用Q Sepharose和PBE94柱和(NH4)₂SO₄法进行纯化。Rabe KS等（Rabe KS,Kiko K,Niemeyer CM.Chemical biology chemical.2008,9:420-425）利用Ni-NTA法纯化后，再过MonoQ离子交换柱后，其纯度方可达到90%。以上的纯化方法都需要用到两次纯化柱甚至三次，在纯化过程中造成酶失活的风险和酶的大量损失。

目前本领域急需建立高效的CYP119酶表达和纯化体系。

发明内容

本发明要解决的技术问题是建立CYP119酶的高效表达体系。

为解决本发明技术问题，本发明提供了含有CYP119酶编码基因的载体。

其中，所述的CYP119酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2或SEQ ID No.4所示。

其中，上述的CYP119酶编码基因的核苷酸序列为：SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示。

进一步的，上述的载体为表达载体。

更进一步的，上述的载体为质粒。

优选的，上述的质粒为pET30a。

优选的，所述的pET30a的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。

再一个方面，本发明还提供了含有上述载体的宿主。

进一步的，所述的宿主为大肠杆菌。

为了更好地得到CYP119酶，本发明还提供了该酶的纯化方法，包括以下步骤：