[发明专利]一种促进牛骨骼肌卫星细胞体外增殖的方法

权利要求书

1.一种促进牛骨骼肌卫星细胞体外增殖的方法，其特征在于包括以下步骤：

第一步、包含牛miR-133b基因序列的目的序列的获取：

根据牛miR-133b基因序列设计一对PCR引物，在两个引物的5’端分别引入XhoI酶切位点和BamHI酶切位点，利用该对引物从牛基因组中扩增出包含miR-133b基因的全长为311bp的一段序列；

第二步、表达载体pEGFP-C1-miR133b的构建：

用XhoI和BamHI双酶切第一步中所得序列及pEGFP-C1载体，通过连接酶连接，使所述序列插入质粒载体pEGFP-C1的XhoI和BamHI酶切位点，构建出牛miR-133b基因的表达载体pEGFP-C1-miR133b；

第三步、pEGFP-C1-miR133b转染牛骨骼肌卫星细胞：

用得到的表达载体pEGFP-C1-miR133b，采用脂质体转染试剂转染牛骨骼肌卫星细胞，使牛骨骼肌卫星细胞过表达微小RNA miR-133b。

2.根据权利要求1所述的一种促进牛骨骼肌卫星细胞体外增殖的方法，其特征在于：所述第一步中包含miR-133b基因的全长为311bp的一段序列进一步包含牛mir-133b基因84bp，基因前序列95bp，基因后序列132bp，总共311bp。

3.根据权利要求1所述的一种促进牛骨骼肌卫星细胞体外增殖的方法，其特征在于：所述第三步采用脂质体转染试剂转染牛骨骼肌卫星细胞是在转染前一天把牛骨骼肌卫星细胞培养到六孔板内，使第二天细胞能达到约70%～80%满，在进行转染前，每孔更换成新鲜的无血清细胞培养液2ml。

4.一种促进牛骨骼肌卫星细胞体外增殖的方法的应用，其特征在于：通过牛骨骼肌卫星细胞过表达微小RNA miR-133b的获取，利用miR-133b的作用，提高牛骨骼肌卫星细胞的体外增殖能力，并有效抑制其分化。