[发明专利]一种促进牛骨骼肌卫星细胞体外增殖的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域的细胞工程技术，具体涉及一种促进牛骨骼肌卫星细胞体外增殖的方法。

背景技术

骨骼肌卫星细胞（skeletal muscle satellite cell）是骨骼肌中具有分化增殖潜能的肌源性干细胞，通常以静息状态存在于肌纤维肌膜与基底膜之间，在一定的条件下可以被激活，发生增殖和分化，形成骨骼肌细胞，肌卫星细胞在动物出生后肌肉的生长发育和再生过程中发挥着十分重要的作用。肌卫星细胞的激活、增殖与分化过程受多种因素的调控，了解骨骼肌卫星细胞的发生调控模式，可以增加人为控制肌细胞形成的可能性。目前骨骼肌卫星细胞的研究工作主要集中于肌卫星细胞的分离培养、鉴定及影响其增殖和分化的机制等方面。在分离肌卫星细胞时往往掺杂着其它细胞，而且骨骼肌卫星细胞在低血清浓度下会自发地分化为骨骼肌细胞，使得要获得大量高纯度的肌卫星细胞具有很大的挑战性，如何提高肌卫星细胞的体外增殖能力并抑制其分化成为高效并经济地获取足量高纯度肌卫星细胞的关键。

骨骼肌增殖和分化过程涉及多基因的表达、信号途径及网络式调控，过程极其复杂。已有研究表明微小RNA（microRNAs,miRNAs）在肌肉发育和肌细胞增殖与分化中发挥了关键性的调控作用。miRNAs是一类广泛存在于真核细胞当中由基因组编码的长度约22nt的高度保守的内源性非编码单链RNA，它们通过与对应的靶mRNA的3’非翻译区（3’untranslated region,3’UTR）的非完全或完全配对结合，阻止其翻译或破坏其稳定性，实现对基因表达的转录后调控。可以利用表达载体将miRNAs转染导入细胞或动物体内，用于研究miRNAs的功能，一般导入细胞或动物体内的miRNAs基因，应使用包含该miRNAs基因前体的一段序列，研究发现所选择的片段至少应该在miRNAs基因前体两侧各自延伸40nt，这样可以使转入基因更有效的被剪切加工成为成熟的miRNAs。miRNAs作用的靶基因几乎覆盖细胞每一条信号通路，参与细胞生长、增殖、发育、分化和细胞凋亡等多个生命活动环节。miR-133是肌肉组织特异性miRNAs，它在心肌和骨骼肌均表达，它参与了肌细胞的增殖与分化、肌肉的生理病理学等过程，具有重要功能。研究发现miR-133在小鼠C2C12成肌细胞分化过程中迅速上调，进一步的功能研究证明miR-133促进成肌细胞的增殖并抑制其分化。研究也证明miR-133能促进大鼠和人胚胎干细胞增殖并抑制其分化。过表达miR-133也能抑制血管平滑肌细胞向成骨样细胞的分化。miRNAs不仅在结构上保守而且在物种间具有高度的进化保守性，预示着某些miRNAs在牛肌肉发育分化中可能具有非常重要的调控作用，因此，验证并确定利用牛miR-133来促进牛肌卫星细胞的增殖并抑制其分化效果，建立牛肌卫星细胞高效的体外培养和纯化方法就成了本领域技术人员亟待解决的课题。

发明内容

鉴于miR-133对肌细胞增殖和分化的影响，本发明的目的在于提供一种通过过表达miR-133b来促进牛骨骼肌卫星细胞的体外增殖能力，并有效抑制其分化的方法，借助此方法并对肌卫星细胞进行纯化可以得到高纯度的牛肌卫星细胞，为研究各调控因子在肌卫星细胞增殖与分化过程中的功能和影响提供良好的细胞模型。

本发明的技术方案如下：

一种促进牛骨骼肌卫星细胞体外增殖的方法，包括以下步骤：

第一步、包含牛miR-133b基因序列的目的序列的获取：

根据牛miR-133b基因序列设计一对PCR引物，在两个引物的5’端分别引入XhoI酶切位点和BamHI酶切位点，利用该对引物从牛基因组中扩增出包含miR-133b基因的全长为311bp的一段序列；

第二步、表达载体pEGFP-C1-miR133b的构建：

用XhoI和BamHI双酶切第一步中所得序列及pEGFP-C1载体，通过连接酶连接，使所述序列插入质粒载体pEGFP-C1的XhoI和BamHI酶切位点，构建出牛miR-133b基因的表达载体pEGFP-C1-miR133b；

第三步、pEGFP-C1-miR133b转染牛骨骼肌卫星细胞：

用得到的表达载体pEGFP-C1-miR133b，采用脂质体转染试剂转染牛骨骼肌卫星细胞，使牛骨骼肌卫星细胞过表达微小RNA miR-133b。

而且，所述第一步中包含miR-133b基因的全长为311bp的一段序列进一步包含牛mir-133b基因84bp，基因前序列95bp，基因后序列132bp，总共311bp。