[发明专利]一种检测端粒酶活性的探针、试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子检测领域，具体涉及一种检测端粒酶活性的探针、试剂盒及方法。

背景技术

高灵敏地检测端粒酶活性对于癌症等相关疾病的早期诊断和药物筛选有重要的意义。传统检测端粒酶活性的技术主要是建立在聚合酶链反应（PCR）基础上的对端粒酶重复片段（TTAGGG）进行扩增（TRAP）来检测端粒酶活性，但是这些方法耗时、操作繁琐，且特异性不好。为了克服基于聚合酶链反应（PCR）的方法的缺点，近年来也发展出了一些不需要聚合酶链反应（PCR）的检测方法，如光纤敏感器，表面等离子共振技术，荧光，电化学等，但这些方法存在检测灵敏度低、操作繁琐、耗时或需将端粒酶结合引物固定在特别的支持物上的缺点。

因此，有必要提供一种简单易行、且能快速、高灵敏地检测端粒酶活性的方法。

发明内容

为解决上述问题，本发明第一方面提供了一种检测端粒酶活性的探针。本发明第二方面提供了一种检测端粒酶活性的试剂盒。本发明第三方面提供了一种检测端粒酶活性的方法。本发明提供的检测端粒酶活性的探针不需要任何的标记和修饰，本发明提供的检测端粒酶活性的试剂盒采用的试剂成本低，本发明提供的检测端粒酶活性的方法具有很高的灵敏度和特异性，本发明提供的基于化学发光反应的端粒酶活性的检测探针、检测试剂盒和检测方法在疾病早期诊断和药物筛选方面具有广阔的应用价值。

第一方面，本发明提供了一种检测端粒酶活性的探针，所述检测探针包括端粒酶结合引物和反向引物，所述端粒酶结合引物依次包括A、B以及C，所述A、B、C均为核苷酸序列，所述A的核苷酸序列为在C的核苷酸序列中加入切刻内切酶的识别位点，所述B具有DNA酶序列，所述DNA酶序列为具有氯高铁血红素结合位点的多G核苷酸序列，所述DNA酶序列的两端具有切刻内切酶的识别位点，

所述核苷酸序列A中，距离A的5’端的15～24个碱基处具有切刻内切酶的识别位点；

所述核苷酸序列C具有被端粒酶识别的序列；

所述反向引物具有与（TTAGGG）n互补的序列，其中，n为6～10的自然数，所述反向引物与所述端粒酶结合引物不互补。

优选地，所述DNA酶序列为如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:5任一所示的核苷酸序列。

具体地，所述SEQ ID NO:1为PW17序列，即GGGTAGGGCGGGTTGGG；

所述SEQ ID NO:2为T30695序列，即GGGTGGGTGGGTGGGT；

所述SEQ ID NO:3为PS2.M序列，即GTGGGTAGGGCGGGTTGG；

所述SEQ ID NO:4为PS5.M序列，即GTGGGTCATTGTGGGTGGGTGTGG；

所述SEQ ID NO:5为AGRO100序列，

即GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG。

可形成分子内平行型G-四联体，该G-四联体可与氯高铁血红素（hemin）结合形成血红素-G四聚体，该血红素-G四聚体是一种DNA过氧化物酶，具有过氧化物酶的催化作用，其在3-氨基邻苯二甲酰肼（鲁米诺）和过氧化氢存在条件下，可催化鲁米诺发生氧化反应并产生化学发光信号；此外，除鲁米诺外，还可催化其他氧化还原发光底物发生氧化还原反应并产生化学发光信号，如3-氨基邻苯二甲酰肼（鲁米诺）、N,N二甲基二吖啶硝酸盐（光泽精）、2,4,5-三苯基咪唑（洛粉碱）、3，4，5-三羟基苯甲酸（没食子酸）或双(2,4,6-三氯苯基)草酸盐（过氧草酸盐）。

此外，端粒酶在端粒酶结合引物的3′端不断添加多G重复序列（TTAGGG），该多G重复序列也能形成分子内平行型G-四联体，该G-四联体可与氯高铁血红素（hemin）结合形成血红素-G四聚体，该血红素-G四聚体是一种DNA过氧化物酶，也具有过氧化物酶的催化作用，能进一步放大化学发光信号。

优选地，所述DNA酶序列两端的切刻内切酶为Nt.BspQI、Nb.BsmI、Nt.AlwI或Nt.BstNBI切刻酶。

优选地，所述C的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。具体地，所述SEQ ID NO:6为AA ACC TAC AAT CCG TCG AGC AGA GTT。

优选地，在所述C的核苷酸序列中加入的Nt.BspQI切刻酶的识别位点后得到所述A的核苷酸序列。

在此优选条件下，所述A的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。