[发明专利]一种制备猪源干扰素-λ3的方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程产品制备领域，具体涉及一种制备猪源干扰素-λ3（IFN-λ3）蛋白的方法和应用。

背景技术

干扰素（interferon，IFN）是人和动物细胞受到病毒感染，或者受核酸、细菌内毒素、促细胞分裂素等作用后，由受体细胞分泌的一种具有高度生物学活性的糖蛋白。干扰素具有生物学活性及其速效多能、无毒害等优点，成为预防和治疗猪病毒性疾病的的理想生物制品。干扰素除具有抗病毒活性外，还具有免疫调节作用，同时可作为免疫佐剂提高疫苗的免疫活性。根据干扰素的生物学活性和抗原活性不同可将其分为三类：IFN-α、IFN-β、IFN-γ，并将具有共同表面受体的IFN-α和IFN-β归属于I型干扰素；而与IFN-α、IFN-β具有不同表面受体的IFN-γ，归属于II型干扰素。

目前，国内外学者对Ⅰ型和Ⅱ型IFN生物学功能和抗病毒作用已经进行了深入的研究，而对于III型IFN的研究却相对滞后。III型IFN又称为IFN-λ，包括IFN-λ1，IFN-λ2和IFN-λ3，由于其基因结构与IL-10相似，所以又称为IL-29、IL-28A、IL-28B。虽然IFN-λ在基因组水平上与IL-10超家族成员具有相似的内含子/外显子结构，但在蛋白质水平上与Ⅰ型IFN关系更为密切。现有研究显示，IFN-λs与IFN-α有相似的抗病毒、抑制肿瘤细胞生长以及具免疫调节功能等生物学活性，但由于其骨髓抑制及毒副作用少而生物学作用具有长效性，且在人医临床试验研究已经取得了突破性进展，有望在不久的将来成为一个新的基因工程药物。因此IFN-λs基因的表达和应用前景成为亟待解决的科研问题。

发明内容

为克服现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种制备猪源干扰素-λ3（IFN-λ3）蛋白的方法，本发明的方法具体地说是利用RT-PCR技术克隆猪源IFN-λ3，并构建了原核表达载体，在原核表达系统—BL21(DE3)plysS表达IFN-λ3。

本发明的另一目的在于提供所述IFN-λ3的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种在大肠杆菌中表达猪源IFN-λ3基因的方法，具体步骤如下：

（1）用poly（I:C）（polyinosinic-polycytidylic acid，多聚胞苷酸）诱导培养ST细胞，收获诱导培养的细胞，用Trizol试剂提取细胞总RNA；

（2）设计扩增猪源IFN-λ3基因全长的特异性引物（S1和S2），以及扩增不含信号肽序列的猪源IFN-λ3的特异性引物（P1和P2），引物如下：

上游引物S1：5’-ATGGCCCTGGGTGGCTCG-3’；

下游引物S2：5’-TCAGACACACAGGTCTCC-3’；

上游引物P1：5’-CGGGTACCGTGCCTGTCCCTGAAGCCC-3’引入Kpn I酶切位点；

下游引物P2：5’-CCGCTCGAGGACACACAGGTCTCCACT-3’引入Xho I酶切位点；

（3）利用引物S1和S2通过RT-PCR技术扩增猪源IFN-λ3基因全长，；

（4）将猪源IFN-λ3基因克隆入pMD-18T载体、进行测序鉴定，获得重组载体pMD-18T-IFN-λ3；

（5）以pMD-18T-IFN-λ3克隆载体为模板，利用引物P1和P2扩增不含信号肽序列的猪源IFN-λ3的基因，并利用Kpn I和Xho I这两个多克隆位点，将猪源IFN-λ3基因定向亚克隆至原核表达载体pET-32a，获得重组表达质粒pET-32a-Po-IFN-λ3；

（6）重组表达质粒pET-32a-Po-IFN-λ3转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS；

（7）确定原核表达系统中表达猪源IFN-λ3的最佳诱导温度、时间和IPTG浓度；

（8）猪源IFN-λ3在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中的诱导表达。

步骤（7）中所述的最佳诱导温度、时间和IPTG浓度为诱导温度为20℃，时间为16h，IPTG浓度为0.4mM。

上述方法获得的猪源IFN-λ3蛋白在制备抗PEDV病毒（猪流行性腹泻病毒，porcine epidemic diarrhea virus）药物中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

①pET载体表达系统表达效率非常高。

②pET载体表达系统携带His标签，便于纯化。